使用细胞增殖染色鉴定斑马鱼 T 细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞

摘要

我们使用细胞增殖染色来识别斑马鱼 T 急性淋巴细胞白血病模型中的静止细胞。染色保留在非分裂细胞中，并在细胞增殖过程中减少，从而能够选择休眠细胞进行进一步检测。该协议提供了一种功能工具，用于在细胞静止的背景下研究自我更新。

摘要

细胞静止是在正常干细胞和癌症干细胞 （CSC） 中描述的一种生长停滞或增殖缓慢的状态。静止可以保护 CSCs 免受抗增殖化疗药物的影响。在 T 细胞急性淋巴细胞白血病 （T-ALL） 患者来源的异种移植物 （PDX） 小鼠模型中，静止细胞与治疗耐药性和干性相关。细胞增殖染料是追踪细胞分裂的常用工具。荧光染料共价锚定在细胞膜上的胺基和大分子中。这允许追踪标记细胞多达 10 次分裂，这可以通过流式细胞术解决。

最终，增殖率最高的细胞将具有较低的染料保留率，因为它会在每次细胞分裂时被稀释，而休眠、分裂较慢的细胞将具有最高的保留。使用细胞增殖染料分离休眠细胞已在 T-ALL 小鼠模型中得到优化和描述。作为现有小鼠模型的补充， rag2：Myc 衍生的斑马鱼 T-ALL 模型提供了一个极好的场所来询问 T-ALL 中的自我更新，因为白血病干细胞 （LSC） 的频率很高，并且斑马鱼便于进行大规模移植实验。

在这里，我们描述了用细胞增殖染料对斑马鱼 T-ALL 细胞进行染色的工作流程，优化斑马鱼细胞的染料浓度，在 体内成功染色的细胞，以及通过从移植动物中分选活细胞来收集具有不同染料保留水平的细胞。鉴于 T-ALL 中缺乏成熟的 LSC 细胞表面制造器，这种方法提供了一种在 体内询问静止细胞的功能性手段。为了获得代表性结果，我们描述了高和低染料保留细胞的植入效率和 LSC 频率。该方法可以帮助研究静止细胞的其他特性，包括药物反应、转录谱和形态。

引言

成体干细胞负责给定器官中分化细胞类型的再生，并且主要以休眠、非分裂状态存在 ^1,2。例如，维持血液的造血干细胞 （HSC） 在很大程度上保持静止状态，只有一小部分进入细胞周期进行自我更新或分化以产生成熟血液成分³。同样，在癌症中，一种称为癌症干细胞 （CSC） 的罕见细胞亚群具有自我更新能力，并负责恶性肿瘤的长期维持⁴。癌症干细胞在体内以静止或缓慢生长的状态存在，这可能使它们能够逃避抗增殖癌症治疗⁵，逃避免疫系统的清除⁶，减少氧化应激，并增强其 DNA 修复途径⁷。即使治疗后留下的少量 CSCs 也有可能使肿瘤重新繁殖，从而导致患者复发⁸。因此，了解细胞静止对于识别 CSCs 的潜在脆弱性和开发靶向它们的新方法具有很大的希望。

细胞增殖染料，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE） 染料及其衍生物，通常用于跟踪细胞分裂的频率⁹。染料渗透到细胞膜上，....

研究方案

在该方案中，我们使用 GFP 标记的斑马鱼 T-ALL 细胞，这些细胞先前在 CG1 菌株中产生，因此可以直接注射到受体同基因 CG1 斑马鱼¹⁵ 中。简而言之，通过将 rag2：Myc 和 rag2：GFP 的 DNA 显微注射到单细胞 CG1 斑马鱼胚胎中产生白血病。使用荧光显微镜从注射后 3 周开始监测动物的白血病发展。分离 GFP 阳性白血病细胞 FACS 并连续移植到受体 CG1 斑马鱼中，以产生具有高 LSC 频率的克隆。Blackburn 等人描述了整个协议的细节¹⁵。

或者，可以通过斑马鱼胚胎的 DNA 显微注射产生原代 rag2：Myc 衍生的 T-ALL¹⁷。用 rag2 驱动的荧光报告基因（如 GFP）显微注射 rag2：Myc 的 DNA 可导致 B 细胞、T 细胞和混合 ALL¹⁸ 的发育。该方案中使用的白血病克隆先前被验证为 T-ALL¹⁵。肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（协议 2019-3399）审查和批准了所有涉及斑马鱼的实验程序。

讨论

已知 LSC 对常规的抗增殖化疗具有耐药性，寻找针对这些细胞的靶向疗法在减少复发发生和改善患者预后方面具有很大的前景²⁰。以前的研究描述了使用 T-ALL PDX 模型中的荧光细胞增殖染色剂来识别与耐药性和干性相关的一小部分静止细胞群¹³。在这项工作中，我们描述了使用类似的细胞增殖染色来分辨 T-ALL 斑马鱼模型中的缓慢分裂或静.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA