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摘要

CRISPR 等技术的一个重大障碍是可能破坏重要基因的脱靶事件。"通过测序进行切割效应的 体外 报告循环化"（CIRCLE-seq） 是一种旨在识别意外切割位点的技术。该方法以高灵敏度且无偏差的方式绘制 CRISPR-Cas9 的全基因组活性。

摘要

通过 测序体外报告 切割效应的循环化 （CIRCLE-seq） 是一种新技术，用于通过对 CRISPR-Cas9 切割的 DNA 进行靶向测序来公正地鉴定 CRISPR-Cas9 的意外切割位点。该方案涉及基因组 DNA （gDNA） 的环化，随后用 Cas9 蛋白和目标向导 RNA （gRNA） 处理。处理后，纯化裂解的 DNA 并制备为 Illumina 测序的文库。测序过程生成双端读长，提供每个切割位点的全面数据。与其他 体外 方法相比，CIRCLE-seq 具有多项优势，包括测序深度要求最低、背景低和 Cas9 裂解 gDNA 的高富集度。这些优势增强了识别预期和非预期切割事件的灵敏度。本研究提供了一个全面的分步程序，用于使用 CIRCLE-seq 检查 CRISPR-Cas9 的脱靶活性。例如，通过在 AAVS1 基因座修饰期间绘制 CRISPR-Cas9 的全基因组意外切割位点来验证该协议。整个 CIRCLE-seq 过程可在两周内完成，为细胞生长、DNA 纯化、文库制备和 Illumina 测序留出足够的时间。将测序数据输入到 CIRCLE-seq 流程中有助于简化切割位点的解释和分析。

引言

基因组工程在过去 20 年中取得了重大进展，一个重要的里程碑是在 2012 年发现了成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）-Cas91。利用细菌 DNA 核酸内切酶的可编程特性，CRISPR-Cas9 技术能够精确靶向和修饰几乎任何 DNA 序列。自成立以来，该系统已经过优化，仅依靠 Cas9 核酸内切酶和向导 RNA （gRNA） 来编辑特定的基因组区域。CRISPR-Cas9 作为治愈疗法的潜力已在针对各种疾病的临床试验中得到证明，例如 Leber 先天性黑朦、转甲状腺素蛋白淀粉样变性和镰状细胞性贫血等 2,3,4。

CRISPR-Cas9 诱导双链断裂 （DSB），这通常通过以下两种机制之一解决:如果模板 DNA 可用，则容易出错的非同源末端连接 （NHEJ） 或更精确的同源定向修复 （HDR）。CRISPR-Cas9 导致 NHEJ 相关插入和缺失 （插入缺失） 的趋势，以及意外基因组位点的切割，限制了其在临床环境中的应用 5,6,7,8,9,10。此外，意外的基因组修饰可以产生隐蔽的剪接位点、无义或错义突变、诱导染色体裂网或赋予细胞致癌潜力——这些结果已在多项基因组编辑试验中观察到11、12、13、14、15.总之，准确识别 CRISPR-Cas9 的脱靶活性对其临床应用至关重要，尤其是在可能改变数十亿个细胞的全身基因疗法中。

可以采用多种方法来识别 CRISPR-Cas9 脱靶切割位点，包括全基因组双链断裂无偏鉴定 （GUIDE）-seq16，它使用双链寡脱氧核苷酸标记活细胞中的 DSB。然而，对这种方法的批评是，假阳性可能来自随机 DSB 或 PCR 伪影，必须通过排除与目标位点相似性差的捕获位点来丢弃。基于整合酶缺陷慢病毒载体 （IDLV） 的方法灵敏度较低，并且可能会遗漏许多脱靶位点17。其他原位方法，如 DSBCapture、BLESS 和 BLISS 18,19,20 涉及固定细胞并直接标记 DSB，但它们受到对即时 DSB 捕获和外源 DNA 缺失的依赖性的限制。Digenome-seq21（一种体外方法）和通过测序选择性富集和鉴定标记基因组 DNA 末端 （SITE-seq）22 都提供了测序解决方案，但分别在背景噪声和单端分析方面存在局限性。通过测序发现原位 Cas 脱靶 （Discover-Seq）23 可通过 MRE11 结合对 Cas9 活性进行体内和原位鉴定，但仅检测样品制备时存在的 DSB24。最后，CRISPR 编辑推理 （ICE） 使用生物信息学方法，使用 Sanger 数据25 稳健地分析 CRISPR 编辑。

本文介绍了通过 测序进行体外 切割效应报告的循环化 （CIRCLE-seq） 的详细程序 :一种体外技术，可灵敏、公正地绘制具有目标 gRNA 的复合物中 Cas9 核酸酶的全基因组脱靶活性26。这种方法从培养目标细胞和分离 DNA 开始，然后通过聚焦超声进行随机剪切，然后进行核酸外切酶和连接酶处理。该过程最终产生环状双链 DNA 分子，然后通过质粒安全的 DNase 处理进行纯化。然后，该环状 DNA 暴露于 Cas9-gRNA 复合物中，Cas9-gRNA 复合物在有意和无意的切割位点进行切割，留下暴露的 DNA 末端，作为 Illumina 接头连接的底物。该过程产生一个多样化的基因组 DNA （gDNA） 文库，其中包含每个核酸酶诱导的 DSB 的两端，确保每个读数都具有每个切割位点所需的所有信息。这允许使用测序覆盖度要求较低的 Illumina 测序，使 CIRCLE-seq 与上述其他类似方法区分开来。需要注意的是，虽然 CIRCLE-seq 作为 体外 方法确实比其他方案具有更高的脱靶灵敏度，但由于不存在其他方法（如 GUIDE-seq16）中存在的表观遗传景观，因此代价是假阳性率更高。此外，DSB DNA 修复及其相关机制不存在于 CIRCLE-seq 中，消除了插入缺失或本来会被观察到的适当修复。

除了描述执行 CIRCLE-seq 的分步方案外，该方案还通过识别 AAVS1 基因座修饰期间发生的 CRISPR-Cas9 全基因组意外切割位点来验证，例如。该方案易于遵循，提供了从诱导多能干细胞 （iPSC） 培养和 gDNA 分离到 gDNA 环化、Cas9-gRNA 切割、文库制备、测序和管道分析的详细说明。鉴于测序覆盖度要求较低，CIRCLE-seq 可供任何能够进行新一代测序的实验室使用。

研究方案

材料 表中列出了用于本研究的试剂、耗材和设备的详细信息。

1. 细胞培养（5 天）

  1. 在整个方案中包括一个阴性对照。准备足够的细胞来额外制备 25 μg gDNA（每个样品 ~2.0e7 个细胞）。
  2. 根据既定方案培养 iPSC27.收集细胞并将它们重悬于 10 mL 的 PBS 中。吸取 6 μL 细胞样品，并以 1:1 的比例用台盼蓝重悬。使用自动细胞计数仪对样品进行计数。
  3. 每管分装 2 x 107 个细胞，然后在 25 °C（室温 （RT））下以 300 x g 离心 3 分钟。这对于多个重复来说已经足够了。移液并丢弃上清液。

2. 基因组 DNA 分离（1 天）

  1. 按照制造商的说明，使用市售的 DNA 纯化试剂盒分离 gDNA:
    1. 将 200 μL PBS 添加到含有细胞沉淀物的 15 mL 锥形管中并重悬。然后，将 3 mL 细胞裂解缓冲液和 15 μL 蛋白酶 K 移液到试管中。将试管倒置 25 次以充分混合。将试管置于设置为 55 °C 和 150 rpm 的水浴振荡器中 3 小时，或过夜以获得最佳 DNA 产量。
    2. 移液管加入 15 μL RNase A，倒置 25 次。置于 37 °C 的水浴中 1 小时。
    3. 将样品在冰上冷却 5 分钟。然后，加入 1 mL 蛋白质沉淀溶液，高速涡旋 20 秒，并在室温下以 2000 x g 离心 10 分钟。蛋白质应在试管底部形成可见的致密沉淀。如果看不到沉淀，请将样品在冰上再孵育 5 分钟，然后再次离心。
    4. 将 3 mL 100% 异丙醇添加到新的 15 mL 锥形管中。小心地将步骤 2.1.3 中的上清液移液到试管中。将试管倒置 50 次以混合，然后在 2000 x g 和室温下离心 3 分钟。在不干扰 DNA 沉淀的情况下，使用连接到真空阱的巴斯德移液器小心吸出上清液，并在干净、不起毛的湿巾上倒置试管。
    5. 将 3 mL 70% （v/v） 乙醇移液到 DNA 沉淀上，倒置 10 次洗涤。在 RT 下以 2,000 x g 离心 3 分钟。然后，小心地倒出上清液。
    6. 保持试管打开，让所得 DNA 沉淀干燥 30 分钟，确保所有乙醇已完全蒸发。移液加入 50 μL DNA 水合溶液，轻轻移液充分混合。
    7. 将样品置于 65 °C 的水浴振荡器中 1 小时，溶解 DNA，然后将样品在 RT 中放置过夜。将样品在 RT 和 2,000 x g 下离心 1 分钟，然后使用 dsDNA BR 检测试剂盒和相关试管用荧光计定量分离的 DNA。

3. gRNA 的制备（7 天）

  1. 从商业来源订购感兴趣的合成 gRNA（参见 材料表）。该方案也与 crRNA/tracrRNA 兼容。

4. gRNA 体外 切割试验

注:此处使用了 AAVS1 基因中的靶标。为了靶向其他感兴趣的基因，设计引物（表 1）以扩增靶标区域，并用定制引物替换以下步骤中的引物。

  1. 准备 PCR 反应:混合 25 μL Phusion 热启动 Flex 2x 预混液（终浓度 1x）、0.5 μL AAVS1 F 引物（终浓度 0.1 μM）、0.5 μL AAVS1 R 引物（终浓度 0.1 μM）、5 μL gDNA（100 ng、20 ng/μL，来自步骤 2.1.6）和 19 μL 无核酸酶 H2O（总体积: 50 μL）。
  2. 使用以下热循环仪参数:变性:98 °C 2 分钟（1 个循环），变性:98 °C 10 秒（10 个循环），退火:72-62 °C（-1 °C/循环）15 秒（10 个循环），延伸:72 °C 30 秒（10 个循环），变性，98 °C 10 秒（30 个循环）。退火:65 °C 持续 15 秒（30 个周期），延伸:72 °C 持续 30 秒（30 个周期），最终延伸:72 °C 持续 5 分钟（1 个周期），保持:4 °C 无限期。
  3. 使用 AMPure XP 微珠纯化 PCR 反应产物。首先，将 1.8 倍体积或 90 μL 的 XP 磁珠移液到 PCR 产物中。移液 10 次以充分混合。将混合物在 RT 下放置 5 分钟孵育。
  4. 使用磁架，将 PCR 反应板放在磁力架上 3 分钟，将珠子与溶液分离。吸出澄清的溶液并丢弃。向磁珠中加入 200 μL 80% 乙醇 （v/v），孵育 30 秒，然后去除乙醇。重复此洗涤步骤两次以确保完全去除乙醇。
  5. 将板放在磁力架上，让样品自然干燥 3 分钟。从磁力架上取下板，加入 40 μL TE 缓冲液，pH 值为 8.0。通过上下吹打 10 次来混合。让样品在 RT 下静置 2 分钟。
  6. 将 PCR 反应板放在磁力架上再放置一分钟。1 分钟后，将上清液转移到新板中。使用分光光度计测量纯化的 PCR 产量，并按照制造商的说明，使用带有光学管联管盖的光学联管联排以及高灵敏度 D1000 ScreenTape 和高灵敏度 D1000 试剂（分子量标准和缓冲液）在 TapeStation 上进行分析。将制备的样品在 -20 °C 下储存长达数月。
  7. 将 Cas9 核酸酶蛋白稀释至 1 μM，如下所示:混合 2 μL 10x Cas9 缓冲液（终浓度 1x）、1 μL Cas9 核酸酶、 化脓性链球菌 （终浓度 1 μM）和 17 μL 不含核酸酶的 H2O，总体积为 20 μL。
  8. 执行无 RNase 程序以防止 gRNA 降解。在 H2O 中将 gRNA（从步骤 3.1 开始）稀释至 3 μM，至总体积为 10 μL。
    注:使用以下公式估计 gRNA 的分子量:ssRNA 的分子量 （g/mol） = （ssRNA 的长度 （nt） x 321.47 g/mol） + 18.02 g/mol。作为参考，3 μM 的 104 nt 长 gRNA 约为 100 ng/μL。

5. DNA 剪切 （3 h）

  1. 首先将控制臂归位，准备 ME220。然后，用纯化的去离子 H2O 填充储液槽。在控制站笔记本电脑上，访问 Water Works 并单击 Fill。将温度调节至 4.5 °C。
  2. 将 25 μg gDNA 转移到微管（微管-130 AFA 纤维螺帽）中。然后，用 1x TE 将试管填充至总体积为 130 μL。使用以下条件将 DNA 剪切至约 300 bp 的平均长度:将 Duration 设置为 10 s; 峰值功率 达到 70; 占空比 % 至 20; Cycles / Burst 至 50;所有这些都会自动将 Avg Power 设置为 14.0。

6. 纯化剪切的基因组 DNA （1 h）

  1. 将剪切的基因组 DNA 分成两份，每份 65 μL。按照步骤 4.3-4.6 中概述的程序，使用 1.8 倍体积的 XP 微珠 （117 μL） 进行纯化。将上清液转移到新的 PCR 板中，并使用分光光度计测量数量。
  2. 根据制造商的说明，在 TapeStation 上运行 1 μL 洗脱的剪切 gDNA，以确保 gDNA 被剪切成约 300 bp 的广泛分布。如果需要，将剪切的 gDNA 在 -20 °C 下储存长达数月。

7. CIRCLE-seq 文库的准备（3 天）

  1. 发夹适配器退火
    1. 在 1x TE 中重悬 oSQT1288（表 1），发夹接头，至终浓度为 100 μM。
    2. 按如下方式进行接头退火:混合 40 μL oSQT1288（终浓度 40 μM）、10 μL 10x STE（终浓度 1x）和 50 μL 无核酸酶 H2O，总体积为 100 μL。
    3. 使用以下退火参数:95 °C 持续 5 分钟，-1 °C 每分钟 70 次循环，无限期保持在 4 °C。
  2. 执行 End repair 。使用无 PCR 的 HTP 文库制备试剂盒并制备末端修复预混液。
    1. 混合 8 μL 无核酸酶 H2O、7 μL 10x 末端修复缓冲液（终浓度 1x）和 5 μL 末端修复酶混合物（终体积 20 μL 总末端修复预混液）。
    2. 将 20 μL 末端修复预混液移液到步骤 4.3-4.6 中剪切的 gDNA 样品中。将 20 μL 末端修复预混液与 50 μL 剪切 gDNA 混合，最终体积为 70 μL。
    3. 将混合物置于 20 °C 的热循环仪中 30 分钟，然后在 4 °C 下无限期保持。
    4. 加入 1.7 倍体积或 120 μL 的 XP 微珠，并按照步骤 4.3-4.6 中的纯化步骤进行作。用 42 μL TE （pH 值 8.0） 洗脱。确保珠子保留在溶液中以备下一步使用。
  3. 执行 A 尾。使用 HTP 文库制备（无 PCR）试剂盒制备 A 尾预混液。
    1. 混合 5 μL 10x A-tailing 缓冲液（终浓度 1x）和 3 μL A-tailing 酶（8 μL A-tailing Master Mix 的总终体积）。
    2. 将 8 μL 的 A -tailing Master Mix 移液到每个含有步骤 7.2.4 中珠子的 DNA 样品中，将 8 μL 的 A-tailing Master Mix 混合到 42 μL 含有珠子的末端修复的 DNA 中（最终总体积为 50 μL）。置于 30 °C 的热循环仪中 30 分钟。在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1.8 体积或 90 μL 的 PEG/NaCl SPRI 溶液（HTP 文库制备试剂盒的一种组分（无 PCR;96 次反应））移液到 A 尾 DNA 中。根据步骤 4.3-4.6 纯化 A 尾 DNA。在 30 μL TE （pH 8.0） 中洗脱 A 尾 DNA。将珠子保存在溶液中以备下一步使用。
  4. 进行接头连接。使用 HTP 文库制备（PCR-free）试剂盒，制备接头连接预混液。
    1. 混合步骤 7.1.3 中的 10 μL 5x 连接缓冲液（终浓度 1x）、5 μL DNA 连接酶和 5 μL 退火发夹接头 （40 μM）。确保总接头连接预混液的最终浓度为 4 μM，总浓度为 20 μL。
    2. 将 20 μL 接头连接预混液移液到每个洗脱的 DNA 样本中，该样本含有步骤 7.3.3 中的珠子（每个样本的总最终体积为 50 μL）。
    3. 置于 20 °C 的热循环仪中 1 小时。在 4 °C 下无限期保持。
    4. 将 1x 体积或 50 μL 的 PEG/NaCl SPRI 溶液转移到接头连接的 DNA 中，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。用 30 μL TE（pH 值为 8.0）洗脱，然后将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。使用 dsDNA BR 检测合并并定量 DNA。如果需要，将纯化的接头连接的 DNA 在 -20 °C 下储存长达 1 个月。
  5. 制备 Lambda 核酸外切酶/核酸外切酶 I（大肠杆菌） 预混液（用于去除两端未连接接头的单链或双链 DNA）。
    1. 从步骤 7.4.4 中取出 1 μg 接头连接的 DNA，将其稀释至 40 μL。混合 5 μL 10x 核酸外切酶 I 反应缓冲液（终浓度 1x）、4 μL λ核酸外切酶（终浓度 0.4 U/μL）和 1 μL 核酸外切酶 I（大肠杆菌）（终浓度 0.4 U/μL），得到总体积为 10 μL 的 Lambda 核酸外切酶/核酸外切酶 I 预混液。
    2. 将 10 μL Lambda 核酸外切酶/核酸外切酶 I 预混液移液到 40 μL （1 μg） 接头连接的 DNA（总体积为 50 μL）中。置于热循环仪中，37°C放置1小时，然后在75°C放置10分钟。在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1.8 倍体积或 90 μL XP 珠子移液到 Lambda 核酸外切酶/核酸外切酶 I 处理的 DNA 中。根据步骤 4.3-4.6 中的说明进行纯化。在 40 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。确保磁珠保留在溶液中，用于下一个酶促步骤。
  6. 用 USER 酶和 T4 多核苷酸激酶 （PNK） 处理。制备 USER/T4 PNK 预混液（释放 4 bp 突出端和制备后续连接反应所需的即用型 DNA 末端）。
    1. 混合 5 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液（终浓度 1x）、3 μL USER 酶（终浓度 0.05 U/μL）和 2 μL T4 PNK（终浓度 0.4 U/μL），使 USER/PNK 预混液总体积为 10 μL。
    2. 将 10 μL 的 USER Enzyme/T4 PNK Master Mix 移液到 40 μL 含有步骤 7.5.3 中珠子的 lambda 和核酸外切酶 I 处理的 DNA 标本中，总体积为 50 μL。置于 37 °C 的热循环仪中 1 小时。在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1.8 倍体积或 90 μL 的 PEG/NaCl SPRI 溶液移液到用 USER/T4 PNK 处理的 DNA 中，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。在 35 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。使用 dsDNA HS 检测合并定量 DNA。
  7. 进行分子内环化。制备循环预混液。
    1. 混合 8 μL 无核酸酶 H2O、10 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液（终浓度 1x）和 2 μL T4 DNA 连接酶（终浓度 8 U/μL），使环化预混液总体积为 20 μL。
    2. 将 20 μL 循环预混液移液到 500 ng 步骤 7.6.3 中用 USER/PNK 处理的 DNA 中。在 80 μL 中稀释 500 ng 经 USER/PNK 处理的 DNA，然后加入 20 μL 环化预混液（总体积为 100 μL）。在热循环仪中于 16 °C 孵育 16 小时（过夜）。
    3. 向环化 DNA 中加入 1x 体积或 100 μL 的 XP 珠子，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。在 38 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。
  8. 用质粒安全的 ATP 依赖性 DNase 处理。制备质粒安全的 ATP 依赖性 DNase 预混液（降解残留线性 DNA 所需）。
    1. 混合 5 μL 10x 质粒安全反应缓冲液（终浓度 1x）、2 μL ATP（终浓度 1 mM）和 5 μL 质粒安全 ATP 依赖性 DNase（终浓度 1 U/μL），质粒安全预混液总体积为 12 μL。
    2. 从步骤 7.7.3 中移液 12 μL ATP 依赖性 DNase 预混液到 38 μL 环化 DNA 中（总体积为 50 μL）。在热循环仪中于 37 °C 孵育 1 小时，然后在 70 °C 下孵育 30 分钟。在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1 倍体积或 50 μL 的 XP 珠子移液到用质粒安全的 ATP 依赖性 DNase 处理的 DNA 中，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。在 15 μL TE （pH 8.0） 中洗脱。将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。
    4. 合并 DNA 并使用 dsDNA HS 检测进行定量。如果需要，可将环状 DNA 在 -20 °C 下储存长达数月。

8. 在 体外 切割酶纯化的环状 gDNA （2 h）

  1. 使用 Cas9:gRNA 复合物进行 体外 切割。制备 体外 Cleavage Master Mix。混合 5 μL 10x Cas9 缓冲液（终浓度 1x）、4.5 μL 化脓性链球菌 Cas9（终浓度 90 nM）和 1.5 μL gRNA（终浓度 90 nM），使切割预混液总体积为 11 μL。
  2. 将切割预混液在 RT 下保持 10 分钟以形成 Cas9:gRNA RNP 复合物。
  3. 从步骤 7.8.3 中稀释 125 ng 质粒安全 DNase 处理的 DNA，至最终体积为 39 μL。然后，将 11 μL 切割预混液添加到 39 μL 质粒安全型 DNase 处理的 DNA 中，总体积为 50 μL。
    注:在此步骤中包括一个阴性对照样本，该样本包含与 Cas9 缓冲液混合的环状 DNA，不含 Cas9:gRNA 复合物。
  4. 在热循环仪中于 37 °C 孵育 1 小时。 无限期保持在 4 °C。向 体外切割的 DNA 中加入 50 μL（1 倍体积）的 XP 珠子，并按照步骤 4.3-4.6 纯化 DNA。在 42 μL TE 缓冲液（pH 值为 8.0）中洗脱。确保珠子留在溶液中以备下一步使用。

9. 下一代测序文库的制备（4 - 6 小时）

  1. 执行 A 尾。准备 A 尾预混液。
    1. 混合 5 μL 10x A-tailing 缓冲液（终浓度 1x）和 3 μL A-tailing 酶（A-tailing 预混液的总体积为 8 μL）。
    2. 将 8 μL 的 A 型预混液移液到 42 μL 含有步骤 8.4 中珠子的洗脱 DNA 样品中（总体积为 50 μL）。置于热循环仪中，在 30 °C 下放置 30 分钟。 在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1.8 倍体积的 PEG/NaCl SPRI 溶液或 90 μL 移液到 A 尾 DNA 中，并根据步骤 4.3-4.6 纯化 DNA。在 25 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。确保将珠子保存在溶液中，以便进行下一步作。
  2. 进行接头连接。准备接头连接预混液。
    注:必须准备 NEB 接头的一次性等分试样，以防止冻融诱导的 3' T' 水解导致接头二聚体的形成。
    1. 混合 10 μL 5x 连接缓冲液（终浓度 1x）、5 μL DNA 连接酶和 10 μL 用于测序的接头（终浓度为 3 μM），总共 25 μL。
    2. 将 25 μL 接头连接预混液移液到 25 μL 含有步骤 9.1.3 中珠子的 A 尾 DNA 样品中。置于热循环仪中，在 20 °C 下放置 1 小时。 在 4 °C 下无限期保持。
    3. 将 1x 体积或 50 μL 的 PEG/NaCl SPRI 溶液移液到接头连接的 DNA 中，并根据步骤 4.3-4.6 纯化 DNA。在 47 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。确保磁珠保留在溶液中，用于下一个酶促步骤。
  3. 用 USER 酶进行处理（在尿嘧啶残基处产生单个核苷酸间隙）。
    1. 将 3 μL USER 酶（包含在 Dual Index Primers Kit 中）添加到包含步骤 9.2.3 中珠子的接头连接的 DNA 标本中。在 37 °C 孵育 15 分钟。
    2. 向 USER 酶处理的 DNA 中加入 35 μL（0.7 倍体积）的 PEG/NaCl SPRI 溶液，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。在 20 μL TE 缓冲液（pH 值为 8.0）中洗脱。将上清液转移到新的半裙边 PCR 板中，并使用 dsDNA HS 测定法测量 DNA 浓度。预期浓度应约为 2-5 ng/μL。
  4. （可选）在进行下一步之前，可以使用 PippinHT 进行 DNA 大小选择。使用大小范围为 250-850 bp 的 1.5% PippinHT 盒。所得样品可直接用于下一步的 PCR。
  5. 进行 PCR 以添加条形码
    注:确保为每个样品选择的引物序列组合是唯一的。如果可能，每个样品都应具有唯一的 i5 和 i7 条形码。
    1. 制备 PCR 预混液以添加双索引条形码。混合 5 μL 无核酸酶的 H2O、25 μL 2x 热启动预混液（终浓度 1x）、5 μL i5 引物（终浓度 1 μM）和 5 μL i7 引物（终浓度 1 μM）（总预混液体积为 40 μL）。
    2. 将 40 μL PCR 预混液移液到 10 μL 纯化的 DNA 中，该纯化 DNA 经过步骤 9.3.2 中的 USER 酶处理（约 20 ng）（总体积为 50 μL）。
    3. 选择以下 PCR 热循环条件:变性:98 °C 45 秒，1 个循环，变性:98 °C 15 秒，20 个循环，退火:65 °C 30 秒，20 个循环，延伸:72 °C 30 秒，20 个循环，最终延伸:72 °C 1 分钟，1 个循环，保持:4 °C 无限期。
    4. 向 PCR 产物中加入 0.7 倍体积或 35 μL XP 珠子，并根据步骤 4.3-4.6 进行纯化。在 30 μL TE 中洗脱，pH 值为 8.0。将上清液倒入新的半裙边 PCR 板中。如有需要，可将环化 DNA 在 -20°C 下储存长达数月。
      注意:在 Tapestation 上运行 PCR 样品以控制文库的质量并评估接头二聚体的形成。如果检测到接头二聚体，请重复步骤 9.5.4。

10. 通过微滴式数字 PCR 定量 CIRCLE-seq 文库 （dd_PCR） （6 h）

注:也可以使用 qPCR、Tapestation 或类似方法进行定量。

  1. 从文库中的 5 μL DNA（PCR 步骤 9.5.4）开始，与 45 μL 无核酸酶的 TE 充分混合，然后以 50 μL 体积对每个样品进行 1:10 的连续稀释，稀释度范围为 10-1 至 10-8 。
    1. 设置 dd_PCR Master Mix 储备液。混合 11 μL 2x dd_PCR探针混合物（终浓度 1x）、0.055 μL 探针 oSQT1310（终浓度 250 nM）、0.055 μL 探针 oSQT1311（终浓度 250 nM）、0.099 μL 引物 oSQT1274（终浓度 450 nM）、0.099 μL 引物 oSQT1275（终浓度 450 nM）和 6.292 μL 无核酸酶 H2O， dd_PCR 预混液总体积为 17.6 μL。为所有样品制备预混液，以确保体积足以进行准确移液。
    2. 测定三种最低稀释度（10-6、10-7 和 10-8），一式两份（在 96 孔板中）。必须使用非模板对照 （NTC）。
    3. 按如下方式向每个样品中移取 17.6 μL dd_PCR Master Mix:将 17.6 μL 与 4.4 μL 样品混合（向孔中加入不含核酸酶的 H2O，含 NTC），总体积为 22 μL。密封板，然后在室温下以 2000 x g 离心 1 分钟。
  2. 执行液滴生成、热循环和分析。使用 Droplet Reader PCR 系统，将 DG8 小柱（8 孔）转移到小柱支架中。在卡式瓶的油行中，为探针分配 70 μL 液滴发生油。
    注:从步骤 10.1.2 中取出 20 μL 样品。并将其添加到 8 孔小柱的样品行中，用 DG8 橡胶垫圈覆盖小柱，将其放入液滴发生器中，然后关闭它以开始该过程（自动）。完成后，取出小柱，将 40 μL 从 8 孔小柱的液滴行中移入半裙边 96 孔 PCR 板中，确保缓慢移液。
    1. 将加热块放入 PX1 PCR 板密封机中。打开后，封口机将开始加热至 180 °C。将铝箔热封放在板上，确保红线在顶部。将板放入 PX1 中，然后按 Seal。
    2. 选择以下热循环仪条件:酶活化:95 °C 10 分钟，1 个循环，变性:94 °C 30 秒，40 个循环，退火/延伸:60 °C 1 分钟，40 个循环，酶失活:98 °C 10 分钟，1 个循环，保持:4 °C 无限期。
    3. 在微滴检测仪上，打开兼容的软件并选择要读取的孔。选择 ABS 作为实验类型，并为探针 dd_PCR Supermix 。为目标 1 选择 Ch1 Unknown ，为目标 2 选择 Ch2 Unknown 。选择 Apply（应用），然后选择 OK（确定）。将板放入微液检测仪中。对于染料组，选择 FAM/HEX ，然后单击 Run。
  3. 分析 dd_PCR 结果。使用阴性对照作为参考，对双阳性液滴群体进行门控。计算重复值的平均值，然后乘以稀释因子和dd_PCR的 5 倍稀释因子。
    注:每微升总拷贝数计算如下:每微升总拷贝数 = 稀释因子×平均值 5 ×，其中"平均值"表示 Ch1 和 Ch2 的平均定量值。
  4. 将所有样品合并为一个等摩尔浓度的文库。1x 混合文库应包含约 4.5 x 109 个分子，总体积为 5 μL。

11. 下一代测序

  1. 将样品提交给外部机构进行测序，确保记录正确的接头序列。

12. CIRCLE-seq 数据分析 （1 - 3 小时）

  1. 安装 Python 版本 2.7、Burrows-Wheeler Aligner （BWA） 和 SAMtools。从 http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz 下载参考基因组（例如，hg38）。
    注意:如果目标物种的基因组不可用，CIRCLE-seq 计算工作流程可以在不依赖参考的模式下运行。在这种情况下，可以跳过此步骤。
  2. 使用以下命令下载并安装 CIRCLE-seq 管道:（1） git clone https://github.com/tsailabSJ/circleseq.git，（2） cd circleseq，（3） pip install -r requirements.txt。
  3. 创建 YAML 格式 （.yaml） 的清单文件。下面是一个示例清单，可与 CIRCLE-seq 软件中提供的示例数据集一起使用，以测试工作流程。
    注意:（1） 参考基因组:data/input/CIRCLEseq_test_genome.fa;（2） analysis_folder:数据/输出;（3） BWA:BWA;（4） samtools:samtools;（5） read_threshold:;（6） window_size:;（7） mapq_threshold:<值>;（8） start_threshold:<值>;（9） gap_threshold:;（10） mismatch_threshold:;（11） merged_analysis:对;（12） 样品:U2OS_EMX1;（13） 目标:GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGAANGG;（14） read1: 数据/输入/EMX1.r1.fastq.gz;（15） read2: 数据/输入/EMX1.r2.fastq.gz;（16） controlread1: 数据/输入/EMX1_control.r1.fastq.gz;（17） controlread2: 数据/输入/EMX1_control.r2.fastq.gz;（18） 描述: U2OS.使用了以下清单值:read_threshold:4、window_size:3、mapq_threshold:50、start_threshold:1、gap_threshold:3、mismatch_threshold:6
  4. 定义参考基因组 FASTA 文件、用于分析的输出目录以及 BWA 和 SAMtools 命令的路径。定义核酸酶切割样品和对照样品的靶序列和解多路 FASTQ 文件的路径。通过将多个实验包含在单个清单文件中，可以在批处理模式下同时处理多个实验。
  5. 对于基于标准引用的分析，执行以下命令:（1） python /path/to/circleseq.py all - manifest; （2） /path/to/manifest.yaml。
  6. 或者，对于标准的非基于引用的分析，请执行以下命令:（1） Python /path/to/circleseq.py reference-free - manifest;（2） /path/to/manifest.yaml 中。
  7. 执行完整管道时，在为该特定步骤指定的不同 output_folder 中查找每个步骤的输出结果。

结果

在这里，CIRCLE-seq 用于研究复合物中核酸酶诱导的 Cas9 切割位点，其中 gRNA 旨在使用从诱导多能干细胞 （iPSC） 中分离的 DNA 靶向腺相关病毒整合位点 1 （AAVS1）。该 gRNA 之前在我们的出版物27 中进行了描述。从 iPSC 中分离出约 25 μg gDNA，通过聚焦超声剪切，并使用 AMPure XP 微珠纯化选择大小，以产生约 300 bps 的片段。从这 25 μg DNA 中，成功环化约 2-5 ng DNA 用于 体外 Cas9:gRNA 切割。整个过程如图 1 所示。

在使用我们的计算工作流程进行 CIRCLE-seq 程序和分析之后， 图 2A 显示了所有检测到的脱靶和脱靶切割位点的可视化。CIRCLE-seq 管道还提供"合并读数"，通过 R 统计软件进行分析，以产生曼哈顿图，显示检测到的核酸酶诱导的切割位点沿每条染色体映射（图 2B）。

figure-results-692
图 1:CIRCLE-seq 工作流程示意图。 指出了协议的主要步骤。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-1042
图 2:CIRCLE-seq 可视化和曼哈顿图。 （A） 脱靶位点与 AAVS1 基因座的预期靶标的比对。目标序列显示在顶部，其中非目标按读取计数降序排列。原始靶序列的差异由彩色核苷酸显示。显示了 AAVS1 位点的主要意外切割位点的样本。（B） 曼哈顿图说明了检测到的 AAVS1 基因座的意外切割位点。条形高度表示每个染色体位置的读取计数。 请单击此处查看此图的较大版本。

底漆序列 （5'-3'）评论/描述
AAVS1 单向导 RNA （sgRNA）GGGGCCACUAGGGACAGGAU用于 AAVS1 位点的荧光蛋白敲入
AAVS1 正向引物GCTCTGGGCGGAGGAATATG用于 gRNA 体外切割试验
AAVS1 反向引物ATTCCCAGGGCCGGTTAATG用于 gRNA 体外切割试验
oSQT1288/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaTCIRCLE-seq 发夹适配器
oSQT1274AATGATACGGCGACCACCGAGTruSeq F1
oSQT1275CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTruSeqF2 系列
oSQT1310/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/TruSeq 探针
oSQT1311/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/TruSeq 探针

表 1:用于 AAVS1 基因座 CIRCLE-seq 分析的 gRNA 和引物序列。

讨论

在这里，CIRCLE-seq 被证明是一种无偏倚且高度敏感的技术，用于识别整个基因组中核酸酶诱导的 DSB，这些 DSB 是由于靶向 iPSC 来源的 gDNA 中的 AAVS1 基因座而产生的。iPSC 中的 AAVS1 位点是众所周知的安全港位点，通常用作使用 CRISPR-Cas9 的外源基因的整合位点28。我们最近的报告通过将组成型表达的 EGFP 报告基因进行 CRISPR 介导的整合到 AAVS1 位点来研究 EGFP 标记的 iPSC 的潜力，由于 EGFP 在整个细胞谱系中持续存在，因此能够标记和跟踪 iPSC 和分化的 iPSC27。该 iPSC 系可在 体内 用于评估移植后 iPSC 衍生细胞的生物分布。由于该细胞系已经过 CRISPR 修饰，也用于测试 iPSC 的临床应用，因此必须了解并询问潜在的 AAVS1 脱靶位点，以确保安全性和有效性，使其成为测试 CIRCLE-seq 的理想位点。

Butterfield 等人之前发表的研究27 与这项研究之间的一个显着区别是使用修饰的 gRNA 来靶向 AAVS1 基因座。gRNA 可以设计为提高基因组编辑的准确性24。引导序列是影响脱靶和脱靶效率的最关键因素。因此，将所选 gRNA 与其他几种指南进行比较测试，发现具有优异的保真度。此外，一篇关于重编程人成纤维细胞的方法文章证实了这一发现，即含有修饰核碱基的合成加帽 mRNA 受益于抗病毒反应的低激活29,30。虽然低免疫原性在体外检测中可能无关紧要，但当最终目标是开发可用于活细胞的临床相关疗法时，它就变得至关重要。

与类似方法相比，CIRCLE-seq 具有许多优势。例如，Digenome-seq 使用 ~4 亿个读数对核酸酶切割和未切割的 gDNA 进行测序21。这会导致高背景，因此很难过滤掉低频的真实切割位点。由于核酸酶切割的 gDNA 富集，CIRCLE-seq 仅使用 ~3-5 百万个读数，导致低背景。此外，Digenome-seq 和类似方法 SITE-seq 依赖于对单个核酸酶切割的 DNA 末端进行测序。相比之下，CIRCLE-seq 读数包括切割位点的两端，无需参考 21,22,26 即可识别脱靶位点。

CIRCLE-seq 的一个优点是与依赖细胞培养的方法（如 GUIDE-seq）相比，其灵敏度更高。当比较这两种方法时，CIRCLE-seq 能够捕获 GUIDE-seq 检测到的所有脱靶位点，并发现 GUIDE-seq 遗漏的其他意外切割位点。然而，一个显着的区别是 GUIDE-seq 可能受到表观遗传景观的阻碍，而 CIRCLE-seq 可以访问整个基因组。

作为一种 体外 检测，CIRCLE-seq 存在几个局限性，其中第一个是检测假阳性。表观遗传学会阻碍 体内某些位点的核酸酶活性，而超声处理可在 体外消除这些障碍，从而在细胞环境中通常可能无法接近的位置进行脱靶活性。此外，Cas9 在该 体外 测定中以高浓度存在，允许进行体内不可能的 切割。该测定还需要相对大量的起始 gDNA，根据可用资源，这可能会否定该方案的使用。最后，由于当前下一代测序技术的限制，一些脱靶位点可能无法检测到。

最近的一项研究使用了 计算机模拟 方法，其算法确定了许多相关参数，用于比较不同的核酸酶表征方法，包括 CIRCLE-seq 和 GUIDE-seq31。其中两个相关参数是 "cut-site enrichment" 和 "% false positives"。有趣的是，CIRCLE-seq 的假阳性率计算为 88%，但其切割位点富集比其他 体外 方法高出 10 倍。对每种方法的比较分析表明，GUIDE-seq 表现最佳，因为它表现出最高的靶向特异性，只有中等的假阳性率32。这并没有使 CIRCLE-seq 无效，而是暗示了结合使用 CIRCLE-seq 和 GUIDE-seq 的可能性，用 GUIDE-seq 验证 CIRCLE-seq 的发现，因为前者具有更高的灵敏度，而后者是一种基于细胞的方法，具有高切割位点富集。数据还表明，基于扩增子的下一代测序 （NGS） 应该是在潜在候选位点鉴定真正脱靶修饰的首选方法31。该数据表明了一种潜在的策略，即使用 CIRCLE-seq，然后是 GUIDE-seq，然后是基于扩增子的 NGS 来检查脱靶效应。

披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

对美国国立卫生研究院 （R01AR078551 和 T32AR007411）、奥地利营养不良性大疱性表皮松解症研究协会 （DEBRA）、盖茨 Grubstake 基金和盖茨前沿基金提供的资金支持表示最深切的感谢。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2-mL Thin-walled Tubes and Flat CapsThermoFisher ScientificAB1114
1.5% PippinHT cassetteSage ScienceHTC1510
10 mL Serological Pipettes FisherScientific12567603
15 mL Conical TubeFisherScientific339651
150 x 25 mm Tissue Culture Dish FisherScientific877224
25 mL Reagent Reservoir FisherScientific2138127C
2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2602
5 mL Serological Pipettes FisherScientific170355
50 mL Conical TubeFisherScientific339653
50x TAE Electrophoresis Buffer ThermoFisher ScientificB49
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Agencourt AMPure XP Reagent, 60 mLBeckman CoulterA63881
Benchtop Microcentrifuge Eppendorf5400002
BsaI-HF New England BioLabs
Buffer QX1Qiagen20912
Cas9 nuclease, Streptococcus Pyogenes New England BioLabsM0386M
CIRCLE-seq Library Preparation and NGS
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs
ddPCR SuperMix for Probes Bio-Rad1863010
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad1863051
DG8 Cartridges Bio-Rad1864008
DG8 Gaskets Bio-Rad1863009
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14190144Made by Invitrogen
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad1863005
Droplet Reader Oil Bio-Rad1863004
EDTA (0.5 M)ThermoFisher Scientific15575020
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermoFisher ScientificAM9260GMade by Invitrogen
Eppendorf  ThermoMixer Eppendorf5384000020
Equipment
Ethyl Alcohol, PureSigma-AldrichE7023
Exonuclease I New England BioLabsM0293LE. coli
Filter Unit FisherScientificFB0875713
Filtered Sterile Pipette Tips
Focused Ultrasonicator CovarisME220
Genomic DNA Isolation
Genomic DNA Shearing
Gentra Puregene Cell Core Kit Qiagen158043
gRNAsSynthego
HClThermoFisher ScientificA144500
Heracell VIOS Tri-gas Humidified Tissue Culture IncubatorThermoFisher Scientific51030411Need for culturing and expanding iPSCs (37 °C/5% CO2/5% O2)
High Sensitivity D1000 DNA ScreenTapeAgilent5067-5584
High Sensitivity D1000 ReagentsAgilent5067-5585
HTP Library Preparation Kit Kapa BiosystemsKK8235
HyClone Antibiotic Antimycotic SolutionCytivaSV30079.01
IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)Integrated DNA Technologies11050204
Inverted MicroscopeNeed for imaging iPS colonies in bright-field and fluorescent channels
iPSC Culture
IsopropanolSigma-Aldrich190764
Lambda Exonuclease New England BioLabsM0262L
Loading Tips, 10 packAgilent5067-5599
Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate AlpaquaA00400
Microcentrifuge TubeAxygen31104051
Microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap Covaris520045
mTeSR-1 5x SupplementStemCell Technology85852
mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)StemCell Technology85851Media for maintaining iPSC in culture
Nanodrop 8000 Spectrophotometer ThermoFisher ScientificND-8000-GL
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
Optical tube strip caps, 8x stripAgilent401425
Optical tube strips, 8x stripAgilent401428
Other Reagents
PCR Plate Sealer Bio-RadPX1Model Number PX1
PEG/NaCl SPRI Solution Kapa Biosystems
Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix New England BioLabsM0536L
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad1814040
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase EpicentreE3110K
Primers, Adapters and ProbesIDTSequences are listed in Table 1
Proteinase K Qiagen19131
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen28704
QIAxcel Gel Analysis System Qiagen9001941
Qubit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher ScientificQ32853
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher ScientificQ32853
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher ScientificQ32854
Qubit Fluorometer ThermoFisher ScientificQ33226
QX200 Droplet Digital PCR SystemBio-Rad1864001Contain a QX200 droplet generator and a QX200 droplet reader
RNase AQiagen19101
Semi-skirted PCR Plate ThermoFisher Scientific14230244
SeqPlaque GTG Agarose Lonza50110
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher ScientificS33102
T4 DNA Ligase New England BioLabsM0202L
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)New England BioLabsM0201L
T-75 Flasks FisherScientific7202000
Tapestation 4150AgilentG2992AA
Thermocycler with programmable temperature-stepping functionalityBio-Rad C1000 Touch
Tris baseThermoFisher ScientificBP1521
Twin.tec PCR Plate EppendorfE95102034696 wells, semi-skirted, green
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific10977015
USER Enzyme New England BioLabsM5505L

参考文献

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia. N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).
  3. Ledford, H. CRISPR treatment inserted directly into the body for first time. Nature. 579 (7798), 185 (2020).
  4. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).
  5. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  6. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  7. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
  8. Hong, S. A., et al. Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).
  9. Zhang, G., et al. Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA. Nat Commun. 13 (1), 1856 (2022).
  10. Lee, J., et al. Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels. Nat Commun. 14 (1), 1786 (2023).
  11. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  12. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
  13. Has, C., Kiritsi, D. Therapies for inherited skin fragility disorders. Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).
  14. Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells. Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).
  15. Hsieh, M. M., et al. Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease. Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).
  16. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).
  17. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).
  18. Lensing, S. V., et al. DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks. Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).
  19. Crosetto, N., et al. Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing. Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).
  20. Yan, W. X., et al. BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks. Nat Commun. 8, 15058 (2017).
  21. Kim, D., et al. Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).
  22. Cameron, P., et al. Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage. Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).
  23. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  24. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157 (2023).
  25. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  26. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  27. Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter. Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).
  28. Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor. Sci Rep. 10 (1), 21474 (2020).
  29. Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nat Commun. 9 (1), 745 (2018).
  30. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  31. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).
  32. Cromer, M. K., et al. Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells. Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).

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