一种用于多区域体内记录的灵活方便的电生理光导的综合方法

摘要

我们开发了一种简化且经济高效的电极制造方法，并在自由移动的小鼠中跨多个区域进行信号记录。利用光遗传学，以及多区域电生理学和钙信号记录，能够在癫痫发作点燃模型中揭示跨区域的神经元活动。

摘要

癫痫是一种神经系统疾病，其特征是涉及多个大脑区域的同步异常放电。局灶性病变促进癫痫信号通过相关的神经回路传播。因此， 来自 关键大脑区域的局部场电位 （LFP） 的体内记录对于破译参与癫痫发作传播的电路至关重要。然而，目前的电极制造和植入方法缺乏灵活性。在这里，我们提出了一种方便的设备，专为跨多个区域的电生理记录（LFP 和脑电图 [EEG]）而设计。此外，我们将光遗传学操作和钙信号传导记录与 LFP 记录无缝集成。在癫痫发作期间，在几个单独的区域观察到强劲的出院后，并伴有钙信号的增加。本研究中使用的方法为大脑不同区域的同步神经记录提供了一种方便灵活的策略。它通过提供对涉及这些疾病的多个区域的神经特征的见解，具有推进神经系统疾病研究的潜力。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病，其特征是反复发作，表现为抽搐、感觉障碍和意识丧失¹。癫痫的病理生理机制很复杂，涉及多个相互关联的大脑区域 ^2,3。神经影像学的最新进展揭示了涉及癫痫的大规模网络 ^4,5。然而，对癫痫产生和传播的复杂电路和网络机制的理解仍然有限，部分原因是多区域神经记录技术的应用不足⁶。因此，开发一种灵活的集成方法，能够同时监测不同大脑区域的神经活动势在必行。

进行电生理记录以捕获癫痫发作并确定癫痫⁷ 的存在。除了记录电生理活动外，癫痫研究中越来越强调特定神经群的精确钙活性 ^8,9。钙指示剂合成和各种探针设计的进步促使研究人员采用纤维光度法来捕获大脑内神经元活动和神经物质的变化^10,11。检测神经元活动的两种独立方法，即电生理学和纤维光度法记录，相辅相成，有助于更全面地了解动态神经元过程。

此外，同步记录和调节神经活动对于深入了解网络和细胞水平的大脑功能至关重要。这种方法使研究人员能够实时观察和操纵大脑的复杂过程。光遗传学因其独特的选择性刺激或抑制能力而成为探测神经信号转导不可或缺的工具¹²。尽管多位点电生理记录在神经科学中得到了广泛的应用¹³，但多区域电生理记录与纤维光度测量和光遗传学操作的集成仍然有限。更重要的是，目前制造和植入多区域电极的方法缺乏灵活性¹⁴。这些限制阻碍了我们剖析跨多个区域的特定电路功能和相互作用的能力。在这里，我们提出了一种经济高效且方便的多区域 体内 记录方法，该方法阐明了点燃诱导的癫痫发作和其他神经精神疾病中跨区域的神经元过程。

研究方案

该方案获得了复旦大学动物护理和使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》制定的指南和规定进行。采取了所有可能的措施来最大限度地减少本研究中使用的动物数量。执行每个步骤所需的时间包含在相应的步骤中。

1. 电极的制备（图 1）

1. 剪下适当长度的钨丝 （~20 mm） 并烧掉一端的绝缘层，露出钨丝 （1.6-2 mm）。将导线的另一端弯曲成“L”形（参见 图 1A，~1 分钟）
2. 小心地将钨丝的“L”端放在光纤上（参见 图 1B，~1 分钟）。
   注意： 钨丝应比光纤尖端长 0.2-0.4 毫米。
3. 蘸一滴粘合剂并将其涂抹在光纤和钨丝的界面上（参见 图 1C，~1 分钟）。由于液体的表面张力，钨丝会附着在光纤上。
4. 将胶粘剂涂抹一次，然后让其干燥。然后，涂上第二层。这将进一步收紧钨丝和光纤之间的粘合（参见 图 1C，~1 分钟）。
   注意：在应用过程中，应注意防止胶粘剂流到光纤尖端，因为这可能会影响其透射率。
5. 在“L”形的角落，使用粘合剂将光纤的底部和钨丝紧密粘合在一起（~1 分钟）。
   注意：增加的接触面积和胶滴的球形凝固确保了光纤和钨丝之间的牢固粘合。
6. 使用焊接在钨丝和母连接器的引脚之间建立连接（参见 图 1D，每个 ~3 分钟）
   注意：由于钨丝对热不敏感，因此通过切割引脚槽位置来形成金属套管，将两个组件物理地结合在一起，可以将焊接成功率提高到近 100%。随后，填充套管的焊料确保了插入的钨丝和引脚之间的稳定连接。
7. 根据实验设计，焊接所需数量的光电极（参见 图 1E，~10 分钟）
   注意：本研究中使用了三种 optrodes。
8. 将漆包线剪成合适的长度 （~30 mm） 并烧掉两端的绝缘层。将漆包线的一端缠绕在螺丝的底部并焊接。通过烙铁将漆包线的另一端连接到母连接器的引脚，用作颅骨电极的 EEG 记录和接地连接（参见 图 1F，~5 分钟）
   注意：由于漆包线的柔韧性，连接母头骨和母连接器的引脚很方便。将漆包线缠绕在螺钉上后进行焊接比表面贴装焊接更可靠。
9. 将热熔胶涂在母连接器的引脚阵列上，以封装母连接器并确保焊点完全包裹。在热熔胶凝固过程中，使用塑料板对胶粘剂进行塑形，以尽量减少植入过程中的空间占用（参见 图 1F，~3 分钟）
   注意：由于使用热熔胶存在潜在的燃烧风险，AB 胶粘剂被认为是一种更安全的替代品。
10. 接下来，使用光强度计和数字万用表测量光度和电导率。通过这些测试后，设置就可以使用了（参见 图 1G，~2 分钟）
    注意：使用激光时，请始终佩戴适合激光特定波长和功率的防护眼镜。需要高质量的光纤才能将至少 80% 的光从跳线末端传输到植入式光纤的尖端。此外，从钨丝尖端到排针槽的电阻是在 1-5 Ω的可接受范围内测量的。
11. 使用前，将制备好的电极浸入 75% 酒精中 15 分钟，然后将它们转移到无菌盐水中（~16 分钟）。
    注意：封装电极装置的总重量（0.6701 ± 0.01123 g，n = 4）不会影响小鼠的活动。使用等离子体灭菌预先对电极进行灭菌。

2. 电极植入方案（图 2）

1. 用异氟醚 （2%-4%） 麻醉小鼠并将它们固定在立体定位装置中（参见 图 2A，~2 分钟）。在小鼠眼睛上使用眼膏以防止麻醉时干燥。将利多卡因涂抹在颅口切口周边的皮肤上，并以 5 mg/kg 的剂量皮下注射卡洛芬。
   注意：通过没有扶正反射和对脚趾捏的反应丧失来确认适当的麻醉。对于长时间的外科手术，使用注射麻醉剂更合适。
2. 将动物固定在立体定位装置中后，沿颅骨边缘修剪头皮，并用 75% 酒精擦拭颅骨表面，以暴露前囟和 lambda 的位置（参见 图 2B，~3 分钟）。
   注意：术前程序包括剪头发、对手术部位进行消毒、对器械和手术工具进行预消毒。
3. 使用微钻调平大脑并在感兴趣区域 （ROI） 上方钻孔 （~0.8 mm）。用注射泵注射相关病毒（参见 图 2C - F，~20 分钟）。
   注意：有关本研究中病毒和 ROI 的详细信息显示在 材料表 和 图 3 中。
4. 用支架握住 optrodes，将它们的尖端移动到前囟点，将此位置设置为 “零”。使用前囟点作为参考坐标，将光线移动到目标区域（参见 图 2G，~3 分钟）。将 optrodes 放置在病毒注射部位上方 0.3 毫米处。
   注意：在垂直植入策略中，两个电极之间的最小距离约为 2 mm，具体取决于光纤套管的厚度和套圈的外径。倾斜插入方法可用于从位置较近的区域同时录制。
5. 将光纤插入相应的大脑区域后，在它们周围涂抹少量组织粘合剂以覆盖暴露的组织。然后，依次涂抹额外的粘合剂和少许牙科水泥。牙科粘结剂凝固后，小心地松开支架（参见 图 2H，~5 分钟）。
6. 在每次新的光子植入之前，进行重新校准，其中包括重复步骤 2.4（参见 图 2I）。
   注意：对于每次植入，将前囟处的对角定位为“零”点。
7. 植入所有视光后，使用微钻（~1 分钟）在 lambda 点后面钻“地”和新皮层上方的孔以“EEG”。
   注意：钻孔的尺寸 （~1.1 mm） 需要与螺钉的直径相匹配。
8. 将颅骨螺钉插入皮层上方和 lambda 点后面的孔中（参见 图 2J，~5 分钟）。
   注意： 颅骨螺钉分别用于 EEG 记录和接地。
9. 整理钨丝和漆包线，使它们位于植入区域上方，而不是暴露在颅骨外。使用支架固定母连接器的位置（参见 图 2K，~2 分钟）。
10. 用牙科粘固剂填充植入部位，以确保电极装置和颅骨之间的稳定连接。封装内部电线，让母连接器的插入孔暴露在外，以便连接到头部tage（参见 图 2L，~6 分钟）。
11. 牙科粘结剂硬化后，将碘涂抹在裸露头皮周边的皮肤上，然后将动物放在加热垫上（~1 分钟）。
    注意：确保动物在恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前不要无人看管。在整个存活手术过程中应保持无菌条件。
12. 使用抗生素和镇痛药以支持术后恢复。
    注意：接受手术的动物在完全康复之前不会再次与其他动物相伴。动物腹膜内注射头孢曲松钠 （180 mg/kg），皮下注射卡洛芬 （5 mg/kg），利多卡因凝胶每天涂抹于手术伤口，持续 3 天。动物需要存活指定的时间才能完成行为测试。随后，它们将使用 4%-5% 异氟醚被安乐死，然后进行灌注和组织切片，以评估病毒感染和电极植入部位。

3. 体内脑记录协议

1. 在进行信号记录和行为测试（旷场测试）¹⁵ 之前，确保对鼠标进行 3 天的温和处理，以使其适应环境。
   注意：在这项研究中，小鼠被放置在开阔的场地（42 厘米× 42 厘米）中自由移动，使我们能够观察它们的癫痫发作行为。
2. 用异氟醚 （2%-4%） 麻醉小鼠后，在插入头部之前，按照记录部位的顺序依次连接光纤。
3. 将 635 nm 光脉冲设置为 10% 占空比，频率为 20 Hz。在录制过程中将光刺激设置为 10 秒（200 个脉冲）。将光纤尖端的强度设置为 3 mW。
4. 使用光纤光度计系统通过 470 nm LED 通道以 30 Hz 的采样率记录 Gcamp6m 信号行为测试周期。
5. 在光遗传学刺激下同时记录钙信号、LFP 和 EEG，以及相应的行为表现（见 图 3）。
6. 采用晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 信号同步标记，以确保记录数据的时间一致性。

4. 数据处理

1. 将光度数据加载到 MATLAB 软件。然后，使用自定义编码（补充文件 1）对钙信号进行去趋势化。
2. 用公式 （1） 定义荧光强度的变化：
   ΔF/F = （F_t - F₀）/ F₀ （1）
   其中 F_t 表示实时钙信号荧光值，F₀ 表示事件发生前的平均基线荧光强度。
3. 将采样率为 1000 Hz 的电生理数据导入 MATLAB（补充文件 2）。
4. 协调钙信号转导和电生理数据的显示与同步标记物对齐。

结果

我们将光遗传学与多区域电生理记录和钙成像相结合，以观察光遗传学癫痫发作期间各个大脑区域的神经元活动。为此，将表达 ChrimsonR 的腺相关病毒 （AAV） 在 CaMKIIα 启动子 （AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry）¹⁶ 的控制下注射到啮齿动物的经典致癫痫部位梨状皮层 （ROI 1）¹⁷ 中。此外，AAV-hsyn-Gcamp6m¹⁸ 被注射到三个区域 （ROI ...

讨论

在这里，我们采用了一种自制的 optrode 装置来跨多个区域 进行体内 神经信号记录。该系统同时进行光遗传学刺激、钙信号记录和电生理记录的可行性已得到验证。本文描述的电极制备方法是高效且具有成本效益的。根据实验设计，我们可以记录来自相关大脑区域的信号。光的策略安排允许从大脑的多个区域提取丰富的信息。多模态检测范式的整合为剖析错综复杂?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB