自由移动小鼠的同步聚焦超声神经调控和纤维光度记录

摘要

该协议包括换能器制造、参数报告、手术程序和信号记录，用于自由移动小鼠同时聚焦超声神经调控和纤维光度测量记录的整个操作工作流程。

摘要

聚焦超声神经调控 （FUN） 代表了一种很有前途的无创扰动大脑深部区域的神经元回路的方法。它与大多数现有的 体内监测大脑功能的方式兼容。与脑功能记录模式的集成不仅使我们能够通过闭环反馈解决特定大脑功能的秩序和障碍，而且还为我们提供了关于 FUN 本身的机制见解。在这里，我们提供了一种经过修改的、简单的、可靠的和稳健的方案，用于在自由移动的小鼠中同时应用 FUN 和纤维光度法 GCaMP6s 荧光记录。这涉及制造一个大小适中的单个换能器并将其临时放置在小鼠身上，以及安全固定光纤植入物以促进换能器顺利通过。FUN 和光纤光度法的结合提供了在大脑深部区域实时光学记录 FUN 上的神经回路反应。为了证明该方案的有效性，以 Thy1-GCaMP6s 小鼠为例，记录小鼠自由移动时 FUN 期间丘脑前核的神经活动。我们相信该协议可以促进 FUN 在神经科学领域和生物医学超声领域的广泛使用。

引言

聚焦超声神经调控 （FUN） 已成为一种有前途且用途广泛的神经调控工具，能够探索具有巨大潜力的大脑功能和组织¹。FUN 能够以精确定位将声能无创地传递到脑组织内的任何位置²。它能够以安全和无创的方式瞬时和可逆地调节大脑深部结构中的神经活动，具有很高的时空特异性，呈现出一个吸引人的特性，补充了现有的临床神经调控技术³。已在人类受试者 ^4,5,6 和各种动物模型中证实了有效的 FUN 的证明，包括小型^{7、8、9、10} 和大型物种^11、12、^{13、14、15、16、17}。

通过在 FUN 期间通过神经活动监测观察 FUN 对特定神经类型的影响，我们可以深入研究这个过程背后的机制^18,19。基于基因编码钙指示剂 （GECI） 的纤维光度法在过去十年中已被广泛用作跟踪体内细胞类型特异性群体活动的通用方法 20,21,22,23,24。因此，FUN 和光纤光度法的同步应用可以显著丰富我们对 FUN 的综合认识。然而，使用笨重的单个换能器需要固定在框架上，而动物需要接受麻醉并固定在立体定位框架中 7,19,25,26。这种方法可能不适用于与感知、认知和行为评估相关的某些类型的实验。建立一种促进 FUN 和纤维光度测定法融合而不妨碍小鼠动员的方案至关重要⁷。

在这项研究中，我们提出了一种改进的方案，用于无缝和优雅地补充制作单个换能器及其临时固定在小鼠上的方法，以及光纤植入物的安全固定以促进换能器顺利通过^{的方法 7,19,26}.它允许研究人员记录不受约束的小鼠中受超声波调节的神经活动。我们选择了更平滑的包络，例如正弦包络，以减少听觉混淆²⁷。通过在 FUN 期间同时记录自由移动小鼠丘脑前核中的神经活动来证实该协议的可行性。它表明换能器的能量足以实现神经调控，光纤植入物和换能器的固定方法可以保证它们的稳定性。

研究方案

所有程序和动物处理均符合 NSFC 伦理指南和广东省智能科学技术研究院机构动物护理和使用委员会批准的方案要求。

1. 传感器准备

1. 准备一个内径为 3 mm、外径为 7 mm、中心频率为 500 kHz 的压电板。
   注意:外径可以根据目标的特定大脑区域进行调整，并且应在保持刺激精度且不超过小鼠头骨边界的同时最大化。
2. 使用环氧树脂银浆将电线连接到压电板的两侧（图 1）。环氧银浆凝固后，用万用表测量导线两端的电阻，确保近似为 0。
3. 在干净的玻璃板上贴上一层双面胶带。紧贴高度为 8 mm、外径为 8 mm、内径为 7.6 mm 的压电板和铜环，紧紧贴在玻璃板上。
   注意:铜环的内径由压电板的大小决定，以确保板被铜环覆盖。
4. 将外径为 3 mm 的聚丙烯管牢固地插入压电板的中心，并将其牢固地粘附在玻璃板上（图 1）。
5. 准备适量的环氧树脂胶并抽真空。用一次性注射器提取环氧树脂，慢慢注入铜环中。等待约 10 小时，直到环氧树脂凝固（图 1）。
6. 使用电子烙铁将两根电线的松散端焊接到卡口螺母连接器上。取下玻璃板。用酒精清洁换能器表面（图 1）。

2. FUN 的上报参数

1. 将水听器和换能器放入装满去离子水的水箱中（图 2A）。确保定位系统的中心光束（Z 轴）与传感器轴对齐。这种对准可以通过以下方式实现:首先，通过 2D 扫描发现焦平面中的最大视场;其次，确定另一个平面中具有明确最大值的场最大值;第三，比较两个最大值的 X 和 Y 坐标，然后根据需要迭代调整换能器的位置和/或方向²⁸.
2. 将水听器的尖端与换能器表面调整 1 mm 的距离，保持此距离不变，同时将水听器置于换能器右边缘的中间。启动扫描程序以捕获 XZ 平面中的自由声场（图 2B）。
   注意:水听器的构造方法可在 https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control 找到。
3. 沿 Z 轴移动水听器以确定与空间峰值压力相关的深度。在本实验中，空间峰值压力出现在距离传感器表面 3.4 mm 处;在 XY 平面上将水听器移动到换能器右下角时，请保持此距离。启动并启动扫描程序以捕获 XY 平面中的自由声场（图 2B）。
4. 将换能器放在接受手术的小鼠的颅骨上，如步骤 4 所述。如2.1-2.3所述，通过水听器扫描获取XZ平面和XY平面上的经颅声场（图2D）。
5. 读取焦点处的压力幅值，即自由声场和经颅声场中的空间峰值区域。自由声场中焦点处的压力幅值为 730k Pa，经颅声场中为 580k Pa。读取 -3 dB 的焦距尺寸（图 2C，E），以及经颅声场内 XY 和 XZ 平面上的位置，以评估该换能器的声场是否可以覆盖目标大脑区域。
6. 计算机械指数 （MI），FDA 指导文件将其限制在 1.9 以下，以减少气蚀。MI 的计算由以下公式给出:
   (1)
   其中 p_r，.3 表示以 MPa 为单位的峰值稀薄压力，由 0.3 dB ^{cm-1 MHz-1} 的衰减系数调整， f₀ 是以 MHz 为单位的工作频率。测得的跨颅场峰值稀疏压力为 580 kPa，距离传感器 3.4 mm，f₀ 为 500 kHz，因此降额 p_r，.3 为 576.6 kPa。MI 为 0.82。
7. 计算空间峰值脉冲平均强度 （I_sppa），根据 FDA 指导文件，要求平面方向的强度低于 190 W/cm² 。强度的计算公式如下:
   (2)
   其中 p_sp （t） 是空间峰值位置的时变声压， Z 是介质的特征声阻抗（约为 1.5 x 10⁶ Rayls 用于软组织），PD 是脉宽。在方形包络线的情况下，这归结为等式:
   (3)
   其中 A 是空间峰值压力幅值。在超声聚焦位置测得的 A 为 580 kPa，大脑的 Z 约为 1.58 x 10⁶ Rayls，因此方形包膜的 I_sppa 为 10.65 W/cm² ，正弦包膜的 I_sppa 为 10.65 W/cm²。
8. 计算空间峰值时间平均强度 （I_spta），受 FDA 指导文件限制在平面方向上低于 430 mW/cm² 。强度的计算公式如下:
   (4)
   其中 T 是计算平均值的时间段。在方形包络线的情况下，这归结为等式:
   (5)
   其中，直流_脉冲序列 是脉冲的占空比。这里，由于使用了连续波，直流脉冲序列为 1%，因此 I_spta 等于空间峰值脉冲平均强度，方形包络为 106.5 mW/cm² 。MI、 I_sppa 和 I_spta 可以使用软件计算（图 3A）。可以在 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 中找到基于 MATLAB 的易于使用的代码。
9. 报告脉冲定时参数，包括 A_max、脉冲持续时间、脉冲重复间隔、脉冲序列持续时间和包络（图 3B）。

3. 为动物做手术准备

1. 称量 8 周龄雄性 GCaMP6s 转基因小鼠，重量约为 20 克。在无菌盐水中制备含有 10 mg/mL 氯胺酮和 2 mg/mL 甲苯噻嗪的溶液。使用 26G 针头和 1 mL 一次性注射器，以 100 mg/kg 氯胺酮和 20 mg/kg 甲苯噻嗪的剂量腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪溶液。一旦动物对疼痛刺激（例如脚趾捏）没有反应，就开始手术准备。
2. 在手术前，使用推子修剪动物头上的毛发，并用 70% 乙醇和聚维酮碘对该区域进行消毒。
3. 将鼠标置于立体定位框架上的俯卧位置，并确保颅骨水平。将保护性眼药膏涂在动物的眼睛上以保持水分。

4. 外科手术

1. 沿着矢状缝线做一个切口，从枕骨开始到鼻骨的起点。使用手术剪刀去除覆盖两个半球的皮肤。
2. 使用无菌盐水清洁颅骨并消除任何残留的骨膜。
3. 使用棉签将 3% 的过氧化氢涂抹在暴露的颅骨上约 2 秒至 3 秒，以形成微孔。用无菌盐水彻底冲洗，并确保该区域完全干燥。
4. 使用无菌、高压灭菌的钻头在脑区位置上方创建一个直径为 0.6 毫米的钻孔开颅手术，该钻头由与前囟和 lambda 对齐的立体定位图谱确定。用无菌盐水洗去所有碎屑并确保彻底干燥。小心不要损坏任何组织。
5. 将光纤套圈（植入物）插入探头支架并将其连接到立体定位臂。
6. 使用立体定位臂将植入物直接对准感兴趣区域的上方。将光纤插入脑组织时，以大约 2 mm/min 的速度缓慢推进光纤。
7. 混合牙科粘接剂以达到易于涂抹整个颅骨的粘度。使用无菌牙签在颅骨上和种植体的下部涂抹一层薄薄的牙科粘固剂。让它完全干燥。
8. 小心地拆下探头支架。准备一根高 3 毫米、外径 3 毫米、内径 2.6 毫米的聚丙烯管，然后在整个长度上切割管子。
9. 使用镊子将管道连接到植入物的底部。将牙科水泥粉倒入管道中，确保种植体上方有足够的长度来记录光纤信号。加入所需的液体，让牙科粘接剂凝固几分钟。
10. 找到管道的开口并小心地夹住它，用镊子取下管道。准备牙科粘接剂混合物以进行应用，确保在颅骨上铺上均匀而薄的一层。用牙科粘结剂尽可能多地覆盖颅骨上的表面积。等待几分钟，让牙科粘结剂凝固。
    注意:不要让牙科粘固剂接触鼠标的皮肤。
11. 在 3D 打印的戒指上钻三个孔（直径 1 毫米），在水平面上均匀划分，高度为 7 毫米，外径为 10 毫米，内径为 8.4 毫米。将螺钉（1 mm 长）固定到各自的孔中。
12. 将植入物的顶部插入预制换能器的孔中。确保 3D 打印环的内壁光滑，然后将其放在位于鼠标头骨上的换能器周围。确保换能器位于环内的中心。
13. 将牙科粘接剂涂抹在环和颅骨之间的连接处，然后等待几分钟让牙科粘接剂凝固。避免将牙科粘固剂放在换能器和颅骨之间的连接处。
14. 小心地拆下传感器并牢固拧紧螺钉。将鼠标转移到温暖的笼子中，并确保在将其放回原来的笼子之前对其进行监控直至完全恢复。
15. 手术后，皮下注射卡洛芬 （2 mg/kg） 用于镇痛，每 24 小时持续 3 天以控制炎症和疼痛。每天监测动物是否有任何痛苦、异常体重减轻、疼痛或感染的迹象。通常，到手术后^第 3 天，所有小鼠都应该表现出正常的行为。如果在^第 3 天后在小鼠中观察到任何痛苦或疾病的迹象，请遵循安乐死的机构指南。

5. 刺激和信号记录

1. 手术后 7 天，打开气体麻醉机的氧气供应并调整氧气流量调节器，将气体流量设置为 300-500 mL/min。
2. 将鼠标放入感应室中，并关闭输送到面罩的麻醉气体。旋转蒸发器刻度盘以调整适当的麻醉剂浓度 （2%- 2.5%）。
3. 鼠标麻醉后，将其放在带有麻醉面罩的立体定位框架上。关闭感应线，让麻醉气体流入麻醉面罩。调整适当的维持麻醉剂浓度 （1%-1.5%）。
4. 用酒精清洁植入物的顶面，然后将光纤跳线插入准备好的换能器的中心。
5. 使用 3G 针头和 26 mL 一次性注射器将水注入植入物和 1D 打印环之间的空间，以润湿颅骨。使用纸巾吸收多余的水分。
6. 使用 3G 针头和 26 mL 一次性注射器将偶联剂注射到植入物和 1D 打印环之间的空间，以促进超声从换能器轻松传播到大脑。
7. 将植入物连接到光纤跳线。小心地将传感器插入充满耦合剂的区域，并牢固地拧紧螺钉。
8. 将鼠标放在空旷的场地中，让它唤醒。将传感器连接到超声波激励系统，并将光纤跳线连接到光纤记录系统，使鼠标能够自由移动。
   注意: 光纤跳线的长度为 2 米，直径为 1.25 毫米。405 通道的光强度为 20 μW，470 通道的光强度为 40 μW。
9. 激活超声激发装置和光纤记录系统，以便将超声神经调制与光纤信号记录同步。

结果

距离换能器表面 3.4 mm 的 XY 平面和 XZ 平面上自由声场中的声压分布，对应于小鼠丘脑前核的位置，如图 2B、C 所示。这些测量值是通过 XY 域和 XZ 域中的水听器扫描获得的。距离换能器表面 3.4 mm 的 XY 平面和 XZ 平面上经颅声场的声压分布如图 2D、E 所示。测得的自由声压为 730 kPa，对于 500 kHz 中心频率，测得的经颅声压为 580 kPa。测量的头骨厚度平均约为 0.2 毫米。我们假设色散关系近似线性，因此颅骨的衰减系数为 19.98 dB/cmMHz。轻巧的传感器，重约 1.66 g，让鼠标轻松移动，便于观察鼠标在 FUN 下的响应行为和运动轨迹。

光纤信号在 FUN 下记录（图 4B、D），包络分别为方波和正弦波。实验中使用了 5 只雄性小鼠。方波持续 300 毫秒，而连续正弦持续 471 毫秒，这可以确保两个不同 FUN 中的总能量相同（图 4A、C）。光纤信号的增强表明神经活动的增加。在 FUN 作用下神经反应迅速，表明换能器具有足够的能量和出色的聚焦能力。

图 1:传感器的生产过程。 反过来，这涉及将压电片连接到电线上，然后进行封装。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:超声换能器的超声场测量设置和表征。 （A） 超声场测量的装置包括水听器、电机系统、控制软件、信号发生器和示波器。 （二、二） 超声换能器在自由和经颅声场中的测量示意图以及横向和纵向声场测量的结果。 （C、E） 换能器焦点位置的横向声场图，红线表示 -3 dB 位置的声场。 （女、G） 水听器为传感器测量的输出波形图。红色虚线框内的区域和蓝色虚线框内的区域分别表示波形达到稳定幅度之前的周期和最后传感器的振铃周期。橙色虚线框内的区域代表波形的稳定部分，用于计算压力幅值，记为 p。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:计算软件和超声参数。（A） 自制超声参数计算接口。MI、I_sppa 和 I_spta 是计算的。该接口可以从 https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation 获得。（B） 超声压力波形示意图。使用正弦脉冲包络和矩形脉冲包络。周期 （T） 表示工作频率的单个周期的持续时间。脉冲称为单次连续超声处理，持续指定的持续时间，称为脉冲持续时间 （PD）。通常，脉冲以称为脉冲序列的顺序重复。脉冲序列中两个连续脉冲之间的时间间隔称为脉冲重复间隔 （PRI），计算为脉冲重复频率 （PRF） 的倒数。整个脉冲序列（称为脉冲序列）具有特定的持续时间，称为脉冲序列持续时间。间隔时间是指单次 Trial 的持续时间。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:FUN 期间的光纤光度测量信号。（A、C） 超声参数由方格 （B） 和正弦 （D） 包裹。 （二、二） （A） 和 （C） 的 FUN 期间的光纤光度信号。绿色阴影是 FUN 的持续时间。实线是平均值，蓝色和红色的阴影是记录信号的平均值和标准差。实验中使用了 5 只雄性小鼠。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

这种方法将 FUN 与光学光度计记录相结合，能够研究小鼠脑功能和 体内 FUN 机制。概述了从换能器制造到外科手术的完整操作过程，使研究人员能够在现场之外独立执行 FUN。

该协议的一个关键方面是确保光学植入物顺利插入换能器，颅骨上的牙科粘接剂足够薄，以便超声穿透大脑，光学植入物牢固地连接到颅骨以防止在实验过程中移动，并且换能器的能量输出足以进行有效的神经调控。种植体周围牙科粘接剂的厚度应等于或小于换能器孔的直径。因此，建议在换能器制造过程和手术中使用相同的聚丙烯管。由于聚丙烯管不会粘附在牙科粘接剂上，因此选择将牙科粘接剂模压在种植体周围，并进行侧面切割，以便于拆卸聚丙烯管。

电生理记录和光学光度测量记录是监测体内大脑活动的常用技术，可提供高时空分辨率。然而，电生理记录捕获了来自直接连接到电极的神经元的放电活动信号。超声波可以直接振动电极，从而产生不必要的混淆效应。幸运的是，侵入性较小的纤维光度测量技术可以捕获其下方神经元的活动，这可以减少超声波振动对植入物的混杂影响 ^7,19,26。因此，在自由移动的小鼠中同时聚焦超声神经调控和纤维光度记录的技术允许研究超声神经调控的体内机制，并能够在没有麻醉干扰的情况下观察小鼠的行为反应。

然而，光纤光度法的空间分辨率受到限制，因为它无法监测亚细胞和微电路的活动²⁴。此外，它提供了神经元活动的间接表示，因为它不直接记录神经元活动产生的电信号。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	Injection needles
26-gauge needle	Jin mao	JM-J02	Preparation needles
70% ethanol	Dong de alcohol	0.7	Disinfect
alcohol	Dong de alcohol	0.75	Clean the transducer surface
Bayonet Nut Connector	Risym	75-5	The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device
copper ring	Guowei Metal Materials	Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm)	The outer protective case of the transducer
disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe
double-sided tape	3M	3M55236	It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying
electronic soldering iron	Victor	868A+	The soldered wires are connected to the BNC
epoxy resin glue	Kraft	K 9741	Seal the rear of the transducer
epoxy silver paste	Vonroll	CB-052	The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low
fader	JOQO	YP-7021	Remove the head hair of the mouse
gas anesthesia machine	RWD	R500	It is used for anesthesia in mice
glass sheet	Square glass	80mm*80mm	A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape
ketamine/xylazine	Shutai/shengxin	Zoletil 50/2ml*10	Anesthetize the mouse
medical coupling agent	Bestman	120g	The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal
mouse	Bai shi tong	GCaMp6	Test subject
ophthalmic ointment	Yun Zhi	0.5% x 2.5 g x1	Moistens the eye area to prevent blindness
piezoelectric plate	Jiaming Electronics Factory	Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm)	The electrical energy is emitted in the form of ultrasound
polypropylene pipe	Baihao Pipe Factory	Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm)	Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes
povidone-iodine	lefeke	500ml	Disinfect
signal record of fiber	Thinker Tech Nanjing Biotech	Three-color single-channel fiber optic recording system	Record fiber photometry signals
stereotaxic frame	RWD	68805	Fix the head of the mouse and localize the brain region
sterile saline	Shijiazhuang si yao	500ML,4.5g	As a solvent, dissolves the drug
stimulation of ultrasound	Deep Brain Technology	DB-USNM	Provides stable input to the transducer
weighing machine	Qin bo shi	1718	Weigh the mouse
wire	Jinpeng Cable Factory	0.3mm2	Voltage is supplied to the transducer