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摘要

在这里，我们描述了使用无创和实时全身体积描记法 （WBP） 系统测量咳嗽以及收集小鼠组织样本的标准程序，并介绍了一些评估气道炎症的方法。

摘要

持续 8 周以上的慢性咳嗽是需要医疗护理的最常见主诉之一，患者承受着巨大的社会经济负担和生活质量的显着下降。动物模型可以模拟咳嗽的复杂病理生理学，是咳嗽研究的重要工具。检测咳嗽敏感性和气道炎症，对于研究咳嗽的复杂病理机制具有重要意义。本文介绍了使用无创和实时全身体积脉搏波 （WBP） 系统测量咳嗽，以及收集小鼠组织样本（包括血液、肺、脾脏和气管）的标准程序。它介绍了一些评估气道炎症的方法，包括苏木精和伊红 （HE） 染色的肺和气管切片的病理变化，支气管肺泡灌洗液 （BALF） 上清液中总蛋白浓度、尿酸浓度和乳酸脱氢酶 （LDH） 活性，以及 BALF 的白细胞和差异细胞计数。这些方法是可重复的，可作为研究咳嗽复杂病理生理学的宝贵工具。

引言

咳嗽是一种重要的防御行为，可以维持气道通畅并保护肺部免受潜在有害物质的侵害。然而，当失调时，咳嗽就会成为一种病理状况1。慢性咳嗽，通常定义为持续八周或更长时间，是需要就医的最常见症状之一2。由于慢性咳嗽经常持续数年，患者承受着巨大的社会经济负担和生活质量的显着下降 3,4,5。慢性咳嗽被广泛认为是一种咳嗽超敏反应综合征，其特征是令人烦恼的咳嗽，通常由低水平的热、机械或化学暴露引发6。咳嗽超敏反应的发生与气道炎症密切相关7。然而，需要进一步阐明调节咳嗽敏感性的病理生理机制。

动物模型可以模拟咳嗽的复杂病理生理学，是咳嗽研究的重要工具 8,9。既往研究发现，病毒感染、肺内干扰素-γ （IFN-γ） 滴注、食管灌注盐酸、污染物暴露、香烟烟雾和柠檬酸可诱发动物咳嗽10、11、12、13、14、15、16、17.为了更好地评估咳嗽和气道炎症，本研究使用非致死剂量的 H1N1 病毒建立了小鼠咳嗽模型。对于咳嗽的检测，临床上已经建立了一些咳嗽测量工具来测量咳嗽，包括主观和客观方法18。评估咳嗽严重程度的主观评价工具主要包括视觉模拟量表、咳嗽评分和生活质量问卷等19,20。然而，它们不太可能用于评估动物的咳嗽。此外，可以通过咳嗽激发试验和咳嗽频率监测客观评估咳嗽。使用全身体积描记法 （WBP） 系统的咳嗽激发试验是一种广泛用于动物研究的客观方法，用于测量咳嗽敏感性并揭示咳嗽的潜在机制13,16。根据咳嗽反射的神经解剖学特征，柠檬酸、辣椒素、5'-三磷酸腺苷 （ATP）、异硫氰酸烯丙酯 （AITC） 和炎症介质缓激肽通常用作诱导咳嗽的镇咳剂21,22。柠檬酸是最早和最广泛使用的触发咳嗽反射的咳嗽剂之一，已被验证可用于测量咳嗽敏感性。此外，柠檬酸激发试验具有良好的安全性、可行性和耐受性，建议评估对咳嗽疗法的咳嗽反射敏感性23。因此，本文将介绍使用无创实时 WBP 系统测量小鼠对柠檬酸反应的咳嗽敏感性的方法。

咳嗽病理生理学的研究需要测试样本，包括来自血液、支气管肺泡灌洗液 （BALF） 以及肺和气管组织的样本，以验证关键因素水平的变化24。目前，缺乏收集小鼠组织样本的规范程序，相关研究采用了不同的方法，使气道炎症的评估复杂化。支气管肺泡灌洗是评估呼吸系统疾病气道炎症的重要方法25。不同的支气管肺泡灌洗方法将导致相关研究之间缺乏可比性。此外，不同的支气管肺泡灌洗方法对 BALF 中的炎性细胞和炎性细胞因子有影响。因此，本文将描述使用非致死剂量的 H1N1 病毒建立小鼠咳嗽模型，使用 WBP 系统测量咳嗽，以及一种可靠、安全且非常成功的小鼠支气管肺泡灌洗方法。

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研究方案

所有程序均已获得广州医科大学 （20240248） 动物护理和使用委员会的批准，并严格按照批准的指南执行。本研究使用体重 20-25 g 的雄性无特异性病原体 C57BL/6 小鼠。所有小鼠均在受控温度 （22 ± 2 °C）、湿度 （50% ± 20%） 和照明 （6:30 AM 至 6:30 PM） 下饲养在实心底部笼子中，随意提供食物和水。协议的时间线如图 1 所示。

1. 建立咳嗽小鼠模型

  1. 使用甲型流感/加利福尼亚/7/2009 （H1N1） 病毒。确定小鼠中 H1N1 病毒的致死剂量。
    1. 简而言之，用戊巴比妥钠 （80 mg·kg -1） 麻醉小鼠 （n = 10/组），然后鼻内感染 10 倍连续稀释的病毒。
    2. 在 15 天内监测死亡情况。通过 Reed-Muench 方法26 计算中位致死剂量 （LD50）。
  2. 用 H1N1 病毒感染小鼠。
    1. 将 0.8 x LD50 的 H1N1 病毒溶解在 50 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
    2. 用戊巴比妥钠 （80 mg·kg-1） 麻醉小鼠。
    3. 当小鼠被深度麻醉时，将小鼠置于仰卧位，鼻孔朝上。
    4. 使用移液管将 5-10 μL H1N1 病毒溶液或 PBS 溶液（作为对照）鼻内滴入小鼠的一个鼻孔中（图 2A）。
    5. 然后，用拇指闭上老鼠的嘴巴，使其鼻子用力吸气，使鼻腔中的 H1N1 病毒溶液完全吸入肺部（图 2B）。
    6. 在小鼠的另一个鼻腔中重复步骤 1.2.4 和 1.2.5。
    7. 当步骤 1.2.1 中制备的所有 H1N1 病毒鼻内滴入小鼠肺部时，将其置于仰卧位休息（图 2C）。
  3. 使用 Buxco 小动物全身体积描记系统测量模型建立后小鼠的咳嗽敏感性。第 21 天，用戊巴比妥钠 （150 mg·kg -1） 腹膜内麻醉小鼠。收集和处理血液、脾脏、BALF、肺和气管组织（图 1）。

2. 咳嗽敏感性测量

  1. 制备柠檬酸 （0.4 M）:将 0.1537 mg 柠檬酸放入 5 mL 离心管中，加入生理盐水至体积为 2 mL。
  2. 仪器检查
    1. 检查通道:根据制造商的说明连接全身体积描记器腔室，然后单击校准按钮 - 校准按钮由橙色变为绿色，表示校准成功（图 3A）。
    2. 校准雾化器:
      1. 连接雾化器后，向雾化器中加入 500 μL 生理盐水，然后单击雾化按钮。
      2. 当雾化器中的液体完全雾化时，再次点击雾化按钮，可以看到雾化器的功率，一般约为 0.3 mL/min。再次单击 nebulization 按钮以接受当前的雾化电源。
    3. 检查通道后，确保误差值小于 0.5%。
  3. 设置参数
    1. 单击 Create New Study，选择 Cough 选项，选择 Mouse in Species，然后单击 Next。
    2. 选择 CCnt 参数:将驯化期的持续时间设置为 1 分钟，将响应时间设置为 10 分钟，将气溶胶体积设置为 1 mL，将递送持续时间设置为 10 分钟。
    3. 将有意识的无拘无束的小鼠放入单独的塑料透明全身体积描记器室中。输入鼠标的 Weight 和 Subject ID ，然后单击 Next。
    4. 向雾化器中加入 1 mL 柠檬酸 （0.4 M） 溶液，并观察 CCnt 的实时变化（图 3B）。
    5. 柠檬酸用完后，单击 File and End Session 完成实验。

3. 收获小鼠的血液、脾脏、BALF、肺和气管组织（图 4）

  1. 采集血液。
    1. 咳嗽检测后，通过腹膜内注射用戊巴比妥钠 （150 mg·kg-1） 麻醉小鼠。从深度麻醉的小鼠的眼眶收集血液。在 4 °C 下将 1 mL 血液与 0.1 mL 抗凝缓冲液（9.9 mg/mL 肝素钠溶于 PBS）混合（图 4A）。
    2. 摇动采血管，使血液和抗凝剂充分混合，以防止血液凝固。
    3. 将收集的血液在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。 收集上清液，将其储存在 -80 °C（用于细胞因子测量），并将沉淀重悬于 1 mL D-Hank 溶液中。将 10 μL 血细胞悬液涂抹在载玻片上以确定细胞谱。
  2. 收割脾脏。
    1. 打开小鼠的胸部，收集血液，并通过动脉放血（图 4B）。
    2. 取出左耳廓，然后用 5 mL 生理盐水灌注肺循环和体循环（图 4C、D）。使用手术钳从小鼠身上去除整个脾脏（图 4E）。
    3. 测量脾脏的重量后，将其切成两半。在室温 （RT） 下用 4% 多聚甲醛固定前半部分以进行组织病理学分析。将后半部分储存在 -80 °C 用于细胞因子测量。
  3. 支气管肺泡灌洗
    1. 使用巴斯德移液管制作支气管肺泡灌洗管。使用酒精灯加热巴斯德移液器。当它变软时，将其拉长以形成细管。支气管肺泡灌洗管的长度为 5 厘米。上径为 5 mm，下径为 1 mm（图 5）。
    2. 对于 BALF 收集，通过结扎右主支气管来分离右肺。用 0.5 mL 在冰上预冷的 PBS 灌洗 3 次，从左肺收集 BALF。BALF 的回收率超过 80%（图 4F）。
    3. 将收集的 BALF 在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。 收集上清液并测量总蛋白浓度、尿酸浓度、LDH 活性和细胞因子浓度。
      注:根据制造商的指南24，使用检测试剂盒检测 BALF 上清液中的炎症标志物，包括总蛋白浓度、尿酸浓度和 LDH 活性。
    4. 将沉淀重悬于 200 μL PBS 中，并在计数玻片的帮助下对 BALF 中的白细胞进行计数。
    5. 要通过差异计数确定细胞图谱，请将 50 μL 细胞悬液涂抹在载玻片上并使其干燥。
    6. 用 4% 多聚甲醛固定载玻片过夜，然后用苏木精-伊红 （HE） 染色。每张玻片将至少 400 个细胞分为中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或嗜酸性粒细胞。
  4. 收集肺和气管组织用于组织病理学分析
    1. BALF 收集后，在 RT 下用 4% 多聚甲醛取出并固定右肺的一半（图 4G）和气管（图 4H）以进行组织病理学分析。将另一半储存在 -80 °C 用于蛋白质印迹、实时定量聚合酶链反应 （qPCR） 和酶联免疫吸附测定 （ELISA）。

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结果

图 6 显示了 HE 染色肺（图 6A、B）、气管（图 6C、D）和脾脏（图 6E、F）病理变化的代表性图像。H1N1 病毒感染导致小鼠肺部炎症改变，包括水肿和许多淋巴细胞和中性粒细胞浸润。H1N1 病毒感染还诱导小鼠气管炎症变化，包括纤毛脱落和炎性细胞浸润 （许多淋巴细胞和?...

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讨论

一些慢性难治性咳嗽和感染后咳嗽是与呼吸道病毒感染相关的常见病症 27。为了更好地评估咳嗽敏感性和气道炎症，本研究使用 H1N1 病毒建立了咳嗽小鼠模型。应根据研究目的为其他研究选择合适的小鼠咳嗽模型。以前的大多数研究在咳嗽的机制研究或新药试验中使用豚鼠作为动物模型 28,29,30。最近的研究表...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

这项工作得到了广州市科技规划项目 （202002030151）、广州市国家实验室重大项目 （GZNL2024A02001） 和呼吸疾病国家重点实验室 （SKLRD-Z-202202） 的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde BiosharpBL539A
Buxco Small Animal Whole Body Plethysmography System DSI—
Calcium-free and magnesium-free Hank’s Balanced Salt SolutionBeyotimeC0219
Citric acidSigma-AldrichC2404
Hematoxylin-EosinBASO BiotechnologyBA-4098
Heparin sodium Alfa AesarA16198
Influenza A/California/7/2009 (H1N1) virusATCCVR-1894
IsofluraneRWDR510-22
Lactate dehydrogenase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
Normal salineGuangzhou Zhongbo Biotechnology1234-1
Pasteur pipetNEST318415
Pentobarbital sodiumMerckP3761
Phosphate buffered saline MeilunbioMA0015
Total protein assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA045-3
Uric acid assay kitThermo Fisher ScientificA22181

参考文献

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