来自头部固定小鼠脑干的急性单单位多电极记录

摘要

该协议描述了一种从头部固定小鼠的脑干获得 体内高密度单神经元记录的方法。这种方法用于测量全身麻醉前和全身麻醉期间腹外侧导水管周围灰质（在快速眼动 （REM） 睡眠期间不活跃的脑干区域）中神经元的动作电位放电。

摘要

基于硅多电极的记录在研究许多大脑区域动作电位的时间分辨率下的神经元活动方面越来越受欢迎。然而，使用多通道探针记录来自脑干等深尾结构的神经元活动仍然具有挑战性。一个重要的问题是找到避开大血管的探针插入轨迹，例如上矢状静脉窦和横静脉窦。损伤这些大静脉会导致大出血、底层脑组织损伤，甚至可能死亡。这种方法描述了通过将前坐标与倾斜方法耦合来靶向脑干结构，使记录探针能够穿透高风险血管结构下方的大脑。与严格的垂直方法相比，倾斜方法最大限度地提高了可以靶向的大脑区域的数量。使用这种策略，可以可重复且可靠地访问腹外侧导水管周围灰质 （vlPAG），一个与 REM 睡眠相关的脑干区域，以在七氟烷麻醉之前和期间在头部固定小鼠中获得单单元、多电极记录。以高时间分辨率记录 vlPAG 和周围细胞核中神经元活动的能力是推进对 REM 睡眠和麻醉之间关系的理解向前迈出的一步。

引言

基于硅多电极的记录越来越受欢迎，用于测量许多大脑区域的神经元活动，具有单动作电位分辨率 1,2,3,4。在过去十年中，高密度录制技术取得了长足的发展。目前的硅基记录电极可以容纳高通道数、光纤和皮层电图 （ECoG） 记录设备 ^5,6。此外，这些电极的慢性植入允许长期记录 ^7,8。

尽管最近的技术取得了进步，但用多通道探针靶向脑干等深部尾部结构仍然具有挑战性。当靶向脑干结构，如腹外侧导水管周围灰质 （vlPAG） 时，一个重大障碍是确定避开主要血管的探针轨迹，例如，矢状上静脉窦和横静脉窦。这些大静脉的损伤会导致大面积出血、底层脑组织损伤，甚至死亡 ^9,10。我们建议从前坐标以一定角度靶向脑干结构，使记录探针能够穿透此类高风险血管结构下方的大脑（见图 1）。与垂直方法相比，这种倾斜的方法最大限度地提高了可用于记录的大脑区域的数量。此外，在需要 ECoG 记录的实验环境中，倾斜的前入路为 ECoG 头戴式设备植入提供了更多的颅骨表面，因为用于探针插入的开颅手术窗口位于更靠前的位置^10,11。

确定负责麻醉诱导的 REM 睡眠变化的特定细胞群和回路仍然是麻醉研究的主要目标。因此，这里的目标是可重复且可靠地访问 vlPAG（与 REM 睡眠相关的脑干区域），以便在七氟烷麻醉之前和期间在头部固定小鼠中获得单单元、多电极记录^12,13。以前的研究使用清醒小鼠 vlPAG 的电生理局部场电位 （LFP） 测量来识别与麻醉相关的神经状态变化^14,15。然而，LFP 测量主要对记录区域内的突触活动敏感，而不是动作电位¹⁶。因此，对麻醉剂如何直接影响 vlPAG 神经元产生的神经活动模式的理解仍然有限。在这里，描述了一种从头部固定小鼠的脑干获得高密度单神经元记录的方法。这种方法也可以适用于记录来自其他各种深脑干和后脑干结构的单神经元活动。

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研究方案

所有研究均已获得弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）机构动物护理和使用委员会的批准。使用 5 只雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄 3-7 个月，体重 25-30 g。此处使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 头板和耳机植入

1. 通过将全氟烷氧基 （PFA） 涂层不锈钢线焊接到 3 针连接器接头上来制作 ECoG 耳机（图 2A）。
2. 基于鼠标立体定位图谱¹⁷ 确定插入坐标。使用勾股定理计算探针插入的角度和深度 - 特别是当文献中的信息很少时 - 是一个合理的起点（图 1）¹⁸。
   注意：最终，坐标将通过反复试验进行调整。为了靶向 vlPAG，在成年小鼠中使用以下坐标：前后 （AP） -3.6 mm，中外侧 （ML） +0.5 mm，背腹 （DV） -4 mm。探头以 20° 角 （AP） 插入。
3. 通过将小鼠置于诱导室（氧气中 1.5%-3% 异氟醚）来诱导全身麻醉。麻醉后，将鼠标放置在立体定位框架中，将动物的鼻子放在鼻锥中，并用头杆稳定头部。
4. 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜损伤。使用温度控制系统将体温保持在 37 °C。
5. 在头皮上涂抹脱毛霜或剃毛，然后用聚维酮碘和 70% 酒精消毒。使用“仅尖端”无菌技术来保持无菌手术区域。
6. 进行脚趾捏合试验以检查麻醉深度。
7. 给予镇痛：卡洛芬 2.5 mg/kg，背部皮下注射。
8. 做一个 5 毫米的头皮切口，去除顶骨和枕骨上方的圆形皮肤斑块。用手术刀刀片刮擦脑膜，轻轻去除脑膜。
9. 使用手术刀刀片切割肌肉附件并露出顶骨和枕骨¹⁹.根据需要涂抹过氧化氢以控制出血并干燥颅骨表面。在干燥的颅骨上涂抹牙科粘接剂和树脂以实现牢固的粘合至关重要。
10. 首先，识别头骨²⁰ 上的前囟和 lambda 标志。然后，调整鼻锥位置以调平颅骨的前后位置，确保两个标志之间的高度差不超过 100 μm。
11. 为了平整颅骨的内侧位置，在前囟和 lambda 之间选择两个相对的点，每个点距离矢状缝合线 1 毫米，并检查它们的水平。如果它们之间的高度差超过 100 μm，则通过操纵头杆来调整颅骨的内侧-外侧位置。
12. 测量前囟和 lambda 之间的距离，并将其与 Franklin-Paxinos 立体定位图谱中报告的距离（通常为 4.2 毫米）进行比较¹⁷。使用测量距离和报告距离之间的差值按比例缩放 AP 坐标。用消毒过的铅笔在颅骨上标记开颅手术坐标。
    注意：如果测得的 bregma-lambda 距离相差 4.2 mm，则需要按比例缩放坐标。立体定向图谱中报告的所有 AP 坐标都对应于标准化的 bregma-lambda 距离。由于老鼠头骨的大小是可变的，因此相应地调整坐标非常重要。
13. 使用立体定向显微操作器，将头板直接放在 lambda 缝合线的顶部，并通过在头板上及其周围涂抹牙科粘接剂将其固定到颅骨上（图 3A、B）。至少等待 10 分钟让水泥干燥。
14. 为两个皮质电极（额叶和顶叶皮层）和一个将用作参考电极（小脑）钻钻孔（直径 0.5 毫米）。将涂层银丝电极的剥离端 （0.5 mm） 放入毛刺孔中，并使用紫外线光激活树脂固定。
15. 用牙科水泥完全覆盖涂有涂层的不锈钢丝，以免金属丝暴露在外。用牙科水泥覆盖头戴式设备的底部和侧面，使其牢固就位。确保头戴式设备固定到位后，前囟和 lambda 缝合线仍然可见（图 2B）。
16. 让小鼠恢复至少 7 天，每天检查动物和手术部位是否有任何异常情况。根据需要服用镇痛药（卡洛芬 2.5 mg/kg，SC）。

2. 硅探针的放置和记录

1. 让鼠标习惯于记录装置和头部固定（至少两天 1.5 小时）（图 2D）。
2. 记录当天，将小鼠置于麻醉室中（异氟醚 1.5%-3% 的氧气溶液）。
3. 将鼠标放置在立体定位框架中，按照 1.3 中的说明调整鼻锥和头杆。在整个立体定位手术中保持麻醉（异氟醚 1.5%-3% 的氧气）。进行脚趾捏合试验以检查麻醉深度。
4. 将眼药膏涂抹在眼睛上并保持足够的体温。
5. 识别前囟和 lambda，确保两个解剖标志之间的高度差不超过 100 μm。
6. 用无菌铅笔在颅骨上找到并标记计算出的坐标，然后在坐标周围创建 2 毫米 x 2 毫米开颅窗口的轮廓。
7. 进行脚趾捏试验以检查麻醉深度。
8. 使用高速钻头创建一个 2 毫米 x 2 毫米的开颅手术窗。涂抹 0.5-1 mL 生理盐水以防止脑表面干燥。使用注射器针头和细镊子去除硬脑膜。
   注意：注意主要血管（矢状窦上部、横窦）以避免出血过多（图 3）。
9. 使用高速钻头为硅探针的参比电极创建一个单独的毛刺孔，通常距离颅窗 ~1-2 毫米。
10. 使用附带的涂抹器在颅骨上涂抹 0.2 mL 低毒硅胶以完全密封开颅手术。
11. 让鼠标恢复约 1 小时。
12. 使用头板和螺钉将鼠标头固定在电生理记录装置上（图 2D）。
13. 用荧光染料 DiI（1：4 DiI：乙醇）涂覆硅探针柄，以便在实验后可以重建探针轨迹。
14. 将探针安装在操纵器上并设置所需的角度。为了靶向 vlPAG，应用 15-20° 的 AP 角。
15. 将记录探针降低到颅窗中心内的大脑表面。首先，手动将探针插入 ~300 μm 的深度。插入到此深度后，慢慢地将探针自动降低（例如，200 μm/min）至目标深度，以尽量减少组织损伤²¹ （图 2C）。
    注意：最初建议手动插入探头。手动探头插入可确保在探头初次插入时弯曲时能够停止和缩回探头。一旦探针完全穿透组织，通常可以安全地以自动模式继续下降探针。
16. 将矿物油涂抹在开颅窗口内的大脑表面，以防止干燥。
17. 插入后让记录探针静置 10 分钟。
18. 使用 Intan 记录控制器以 30kHz 记录来自硅探头和 ECoG 的数据。
19. 记录后 1-2 小时，使用经心灌注技术将大脑固定在 4% 多聚甲醛²² 中。
    注意：由于粘接物的存在，可能很难去除颅骨的喙部。这就是为什么最好通过切除颅骨的背侧部分来切除大脑。
20. 将鼠标斩首，沿着背侧的中线从脖子到下颌切开皮肤。去除附着在颅骨上的肌肉和组织，切掉下颌，以便更容易进入大脑。
21. 如果灌注正确完成，大脑应该会收缩一点，留下足够的空间在枕骨大孔的背侧插入细剪刀。在枕骨上做一个内侧切口，一个外侧和一个对侧切口，大小约为 1 毫米。
22. 使用眼科镊子小心地切除颅骨的背面。从枕骨开始，去除所有颅骨碎片，直到露出整个大脑的背侧。
23. 将微型刮刀滑到大脑下方，从嗅球开始，将大脑舀出。
24. 灌注并取出后，大脑可以在 4 °C 下在 4% 多聚甲醛中储存 24-48 小时。

3. 探针轨迹重建的组织学

1. 使用振动切片机将大脑切成 70 μm 冠状切片。
2. 使用对细胞核进行染色的 DAPI 封固剂将切片固定在载玻片上。盖上玻片并用透明指甲油密封载玻片。
3. 在荧光显微镜上对载玻片进行成像。调整对比度/亮度，使探头轨迹清晰可见。确保生成的 tiff 图像文件大小小于 10 MB，以便 MATLAB 代码顺利运行。使用 MATLAB 代码²³ 重建探针轨迹。

4. 电生理数据分析

1. 使用离线检测和自动分拣软件 （Kilosort） 分析来自硅探针的记录神经信号²⁴。
2. 使用 Phy 将检测到的集群手动分类为多单元或单单元²⁵.当簇具有生理尖峰波形形状、在交叉相关中显示不应期和振幅视图呈正态分布时，将簇分类为单个单元。
3. 将单个单位数据导入 MATLAB 并分析²³.

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结果

五只雄性 C57BL/6J 植入了 ECoG 耳机和头板（图 4A）。恢复后，小鼠在不同日期的两次 1.5 小时的疗程中习惯于头部固定和电生理记录装置（图 4B）。接下来，创建一个 2 mm x 2 mm 开颅手术窗口（图 4C），并在鼠标清醒并头部固定的情况下插入硅探针（图 4D）。使用了两种类型的硅 UCLA ?...

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讨论

脑干核介导呼吸、意识和睡眠等基本功能 26,27,28。脑干的位置（深部和后部）对使用标准技术研究其体内神经元活动提出了挑战。这里提出了一种倾斜的前入路，以允许在头部固定的小鼠中进行可重复的单单元记录。

小心插入多电极硅探针对于确保一致地靶向与 REM 睡眠相?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation