一种在田间限制和安全处理蜜蜂的快速方法

摘要

我们展示了一种经过测试的安全处理田间收集的蜜蜂的方法。这种方法允许通过采样时收集的花粉进行快速作、鉴定、基因采样和确认植物与昆虫的相互作用。这种方法易于适应，提供了一种经济高效、非致命的方法来研究稀有昆虫群。

摘要

提高对许多昆虫传粉媒介的基础生物学和生态学的理解，特别是专业或稀有分类群，是许多研究人员的首要任务。因此，通常需要以无害的方式暂时限制野外采集的生物体，以获取信息或支持额外的研究。该协议代表了一种经过全面测试、快速且廉价的现场方法，用于安全处理受保护关注的蜜蜂，可以很容易地根据特定的项目需求进行定制，包括生物体识别、花粉去除、标记和/或收集非致命组织样本进行基因分析。此方法可以作为研究人员工具箱中的附加选项，以便在出现某些情况时使用。预计这种方法可以适用于其他昆虫物种，以及不同经验和技能水平的个体使用。它对于研究专业蜜蜂或进行宿主特异性研究的研究人员具有重要价值。该协议实现的数据收集对于帮助研究人员解决许多传粉媒介物种、植物-传粉媒介网络结构以及传粉媒介保护和管理计划的关键数据差距非常宝贵。

引言

越来越多的证据支持野生蜜蜂和其他传粉媒介种群数量下降以及随之而来的传粉媒介群落变化 1,2,3,4。持续的损失威胁到对生物多样性维护、生态系统功能和农业生产至关重要的昆虫授粉服务⁵.此外，对于许多野生蜜蜂，尤其是稀有物种，存在重大知识差距，可能会阻碍适当的管理和保护行动 ^6,7。

为了帮助解决这些数据缺陷，研究人员开发了多种方法来研究昆虫传粉媒介、相关栖息地的使用情况及其花卉偏好。虽然通常使用盘式诱捕器、蓝叶片诱捕器、不适诱捕器、涌出诱捕器和手工网直接收集，但其中许多方法都有明显的缺点 ^8,9,10,11。鉴定传粉媒介的常用方法都可能导致生物体死亡，无论是否必须在实验室环境中（例如，使用显微镜）鉴定标本。对于许多昆虫研究来说，死亡率可能是合理和必要的。然而，当与种群状况有限或不确定的濒危、稀有或研究不足的昆虫合作时，研究人员必须降低生物体死亡率、伤害或压力，以减少对这些昆虫种群产生负面影响的可能性。因此，在处理高危物种或可通过其关键区分特征轻松识别的物种时，应尽可能采用破坏性较小的采样方法。

已提出的用于收集蜜蜂遗传物质的非致命方法包括收集粪便、渗出物¹² 和翼尖¹³。然而，由于所需的时间和/或对翅膀的潜在影响，对现场收集的蜜蜂使用这些方法可能是站不住脚的，从而对飞行和其他行为产生负面影响。部分触角去除已被证明不会影响采样的真舌蜂的存活率¹⁴。同样，对中腿跗骨末端部分的采样并没有显著降低 Bombus terrestris 工蜂存活率¹⁵。另一种非致命采样方法包括通过将蜜蜂暂时浸入缓冲溶液中，然后释放它们来收集蛋白质残基¹⁶.生存分析表明，缓冲液冲洗和未冲洗的蜜蜂之间没有显着差异。每种技术都有局限性，在解决特定的研究问题和总体项目目标时应考虑这些局限性。

生物体的准确分类鉴定对于有效研究至关重要。然而，对于许多昆虫传粉媒介分类群来说，这在很大程度上取决于感兴趣的物种以及研究人员或观察者的知识和经验水平。虽然可以在野外识别出许多蜜蜂种类，但有证据支持观察可能至关重要。虽然大多数传粉媒介研究通常收集和保留个体作为证据，但使用照片和视频以及使用虚拟现实的 3D 摄像可以用作区分某些物种的代理，而不会牺牲被观察的个体¹⁷。某些物种之间的区分可能需要特别注意和特定形态特征的照片;在这些情况下，生物体必须能够纵并限制在一个独特的位置，以便能够可靠地拍摄复杂的区分字符。

可以通过多种方式暂时限制蜜蜂进行鉴定，包括冷却标本和/或使用二氧化碳减慢蜜蜂^{的速度 18,19}。然而，这些方法可能会改变行为，导致接受治疗的蜜蜂恢复活动的速度较慢，从而可能影响觅食、生物体适应性或增加捕食风险 20,21,22。此外，此类技术最终会增加生物体被限制和处理的时间。这反过来又增加了生物体的压力和现场处理时间。因此，更安全、更高效的方法将是非常可取的。

许多研究使用从蜜蜂或其他来源收集的花粉来更好地了解觅食偏好，构建植物-传粉媒介相互作用网络，识别环境污染（例如农药残留），并评估营养生态学 23,24,25,26,27,28,29.许多蜜蜂被限制在容器中时会自我梳理。因此，已经使用了³⁰ 的非致命花粉采样方法（例如，微量离心管）。然而，在不进行自我梳理的情况下，使用触感更强的容器，例如本协议中使用的可重复密封塑料袋，可以对特定的身体部位施加温和的压力，使花粉与塑料袋接触，从而获得花粉样本的可能性比使用传统的硬质容器更高。

在这里，我们提出了一个已在三个高危蜜蜂分类群上经过充分测试的方案。虽然劳动强度大，但它允许从昆虫传粉者那里收集全面的数据，同时最大限度地减少对单个生物体的死亡威胁。使用这种方法的总体目标是提供一种安全有效的方法来捕获、识别和安全地释放昆虫。该协议的另一个优点是它克服了传统昆虫采集的许多限制。它提供了一种简单的方法来标记个体、收集非致命遗传物质和收集花粉样本，同时最大限度地减少处理时间和对生物体的压力。虽然传统的昆虫采集方法有很多好处³¹，但为了帮助克服它们的一些局限性，我们建立了一种替代方案，以便在快速安全地释放昆虫之前可以限制昆虫进行识别。根据项目目标，当蜜蜂被限制收集其他重要数据时，也可以采取额外的步骤。

研究方案

1. 现场采集准备

1. 确认项目目标（例如，生物体鉴定、遗传组织采样等）。
2. 查看 材料表 并收集特定于项目目标的所有相关项目。
3. 确保所有数字设备（例如智能手机、相机、手持式全球定位系统 [GPS]）都已充满电，并且备用电池已充电和包装好。

2. 捕获和保护生物体

1. 到达田间时记录感兴趣的场地参数，包括日期、开始时间、田间地点/位置以及可能需要的任何其他相关信息（例如，天气条件、主要地被植物、开花植物等）（图 1）。
2. 使用适当的网技术捕获一只感兴趣的蜜蜂。根据重点物种，通过空中昆虫网或扫网使用手网。
   注：其他捕获技术，例如通过小瓶/离心管收集，也可用于昆虫捕获。
3. 通过网袋目视观察标本，以确定它是否与感兴趣的分类单元相似。如果没有，请安全地释放标本并继续调查。
4. 如果标本似乎是重点物种，请将标本固定在网袋内，使其无法逃脱（例如，通过将网袋的顶部重叠在框架上，扭曲/限制网袋的颈部，或以其他方式关闭任何可能的出口）。
5. 收集可重复密封的样品袋并打开样品袋。
6. 确保感兴趣的蜜蜂靠近网袋的尖端。
7. 用一只手抓住标本正下方的网袋。握住网袋，使网尖（昆虫被限制的地方）朝上，网口（即箍）悬挂在下面。
   注意：大多数昆虫是光养性的，当被限制时，通常会飞向/爬向光线。
8. 用另一只手（即没有握住网袋的那只手）将可重复密封的样品袋引导到网口并穿过网袋，直到一只手碰到样品正下方的手。
9. 小心地松开手的抓握力，将样品限制在刚好足以使握着可重复密封样品袋的手能够移动到带有样品的狭窄区域。注意标本在密闭区域内的位置，以减少被蜇伤、伤害标本和逃脱的可能性。
10. 作可重复密封的样品袋，使其打开得足够大，以便昆虫标本进入。通过在密封件的任一侧施加压力或用拇指和中指在密封件下方扭动袋子来执行此作。
11. 将可重复密封的样品袋开口放在样品上方，然后轻轻地将昆虫放入袋子中。如前所述，由于大多数昆虫都是光养性的，因此将装有可重复密封样品袋的手朝向太阳/天空，从而促进样品进入袋中。
12. 样品进入内部后，牢固密封可重复密封的样品袋。
13. 从昆虫网中取出装有标本的可重复密封样品袋。
    注意：由于昆虫在密封袋中会迅速致命地过热，因此请将标本放在避免阳光直射的地方，最好放在阴凉处或绝缘容器中，直到处理，并限制处理时间。

3. 识别生物体

1. 仔细检查标本以确认它是感兴趣的分类单元。如果它是不同的物种，请安全地释放它并继续调查。
   注意：为避免对标本造成伤害，切勿对袋内的昆虫施加直接压力。可以通过对塑料施加轻微的压力或拉伸袋子的周边以使袋子在试样周围拉紧，从而限制移动来固定标本。
2. 如果可以轻松准确地通过目视确认物种身份，请拍摄照片凭证（图 2）。记录有关标本的任何其他必要信息（例如，捕获时间、特定 GPS 位置、访问的植物、独特标记、大小或颜色观察、捕获前的行为等）。
3. 如果需要检查特定的物理特征以确认身份，请通过可重复密封的样品袋拍摄详细的宏观照片，突出这些关键特征（图 2）。
4. 如果无法通过样品袋获得足够质量的照片以进行特征识别，请切开样品袋的两个非密封角尖之一（即接缝在一起或不可重新密封的角），曝光感兴趣的标本身体部位以进行仔细检查。例如，切一个小孔，只露出头部、腹部或腿部（图 3A-C）。为此，请作标本，使感兴趣的身体部分首先向切割/角孔移动。
   注意：可能需要更改袋子上切的孔的大小和位置以及昆虫的方向，以获得必要的照片。
5. 识别完成后，跳至相关部分，了解后续和所需的方法。触角片段去除技术见第 4 节，昆虫标记见第 5 节，和/或获取花粉样本见第 6 节。

4. 从触角获取非致命性基因样本

1. 用剪刀对角线剪下可重复密封样品袋的两个非密封角（即接合在一起或不可重新密封的角）之一。确保所做的切割最小大于蜂头的宽度（图 4）。
2. 作试样，使其头朝向切割/角孔移动。
   注：此步骤可适用于收集其他组织样本进行遗传分析（例如，整条腿、部分腿）。因此，可能需要改变袋子上切孔的大小和位置以及昆虫的方向以获得必要的样品。
3. 一旦蜜蜂的头部从袋子中伸出，轻轻地对周围的塑料施加压力，使其在昆虫周围拉紧，限制运动（图 3A）。
4. 如果孔太大，将袋子滚动到自身上，以进一步限制孔洞开口并固定标本。如果不确定合适的孔大小，请在蚊帐或飞行笼内执行步骤 4.2 和 4.3，以确保标本不会完全逸出。如果原始边角切口太大，请使用额外的袋子。
5. 放置袋子，使昆虫头直接位于收集容器（例如，含有缓冲溶液/乙醇的微量离心管/小瓶）上，并且遗传样品的容器适当地标有与所有其他样本数据相对应的唯一标本 ID（图 3D）。
6. 使用干净和消毒的解剖剪刀，剪下一段触角的一部分。目视检查容器，确认样品在容器内。
   注意：切割时，在干净、消毒的浅色基材（例如 Kimwipe）上工作会很有帮助。这确保了如果样品没有落入样品采集容器中，可以用镊子轻松取出，污染风险最小。
7. 盖紧组织样品采集容器盖并旋转容器，使样品悬浮在溶液（例如缓冲溶液/乙醇）中。
8. 将组织样本采集容器（连同触角样本）放在安全的容器中，最好放在阴凉、阴凉的地方，避免阳光直射和/或极端温度，例如现场冷却器。
9. 在原始捕获点附近安全地释放标本。
   注意：标本也可以在放行前进行标记（见第 5 节），以便在重新瞄准/重新捕获时轻松识别其已采样。

5. 标记生物体

1. 将样品放入可重复密封的样品袋中，在样品袋中间切一个小孔。
   注意：此孔是在第 4 节中创建的孔的补充。孔不应大于昆虫胸部的面积。应切孔的位置可以根据昆虫的大小和所需的标记区域而有所不同。
2. 对标本两侧的塑料施加轻柔的压力，纵昆虫，使胸部直接位于孔下方（即，胸部的顶部通过袋子暴露出来）。继续轻轻按压以确保样品保持在原位（图 5A）。
   注意：其他标记区域可能更适合某些昆虫（图 5B）。一些用户发现，将现有的孔（来自第 4 节）变大，并在蜜蜂出现时握住蜜蜂的胸部来抓住蜜蜂，这更有帮助（图 5C）。这种方法可能会增加被蜇伤的机会。此外，如果用户觉得更容易，可以修改蜜蜂女王标记设备以限制和标记蜜蜂。然而，这种方法需要转移到不同的设备，并且可能会污染花粉样品。
3. 使用油漆标记笔（或其他被认为适合感兴趣分类单元的标记材料），根据预先确定的项目特定方法标记标本。
   注意：标记方法将根据目标而有所不同，可能很简单，表示个体已被捕获，也可能很复杂，允许识别个体（例如，使用独特的颜色编码或图案）（图 5C）。
4. 将标本固定在原位，直到应用的标记充分干燥。
5. 拍摄被标记的个体以确认独特的颜色和颜色位置。
   注意：可以直接通过可重新密封的样品袋轻松快速地拍摄重新捕获的个体（图 5D）。
6. 在原始捕获点附近安全地释放标本。

6. 花粉样本采集

1. 将标本放入可重复密封的样品袋中，仔细检查是否有可见的花粉。
   注意：由于花粉类型和数量差异很大，有时肉眼在标本上看不到花粉。如果前面的步骤已经完成，则标本中的花粉残留物可能已经在袋子中。
2. 如果标本上可以看到花粉，请通过对标本两侧的塑料施加温和的压力来限制标本的运动。
3. 用手指轻轻摩擦或推动塑料抵挡或含花粉的身体部位，以促进花粉的去除。
4. 如果花粉在标本上不可见，请最大限度地接触标本和塑料之间的接触，看看是否有小的花粉残留物从外皮中去除。
5. 如果可能，请明显确认花粉在可重新密封的样品袋中（图 4）。
6. 在原始捕获点附近安全地释放标本。
7. 牢固密封装有花粉样品的可重复密封样品袋。
   注意：如果在可重复密封的样品袋上切了一个孔，则应将其放入另一个可重复密封的样品袋中，以避免污染或花粉损失。
8. 在可重复密封的样品袋上贴上与昆虫个体和其他数据（例如昆虫物种 ID、日期、位置、时间、性别、花卉访问记录等）对应的唯一标本 ID 的标签。
9. 将装有花粉样品的可重复密封样品袋放在安全的容器中，最好放在凉爽的地方，以保护其免受阳光直射和/或极端温度。
   注意：如果合适，请遵循项目特定的方案进行基于现场的花粉保存（例如，遗传分析、花粉形态学）。

结果

该方法已用于美国东南部的三种高危蜜蜂物种（Osmia calaminthae、Caupolicana floridana 和 C. electa）。迄今为止，已经安全收集和释放了数百只蜜蜂和黄蜂。使用这种方法时没有蜜蜂死亡;那些被指定为凭证样本并作为新位置记录保存在适当管理机构的那些在数据收集后被适当地牺牲。表 1 显示了评估的不同形态学特征以及可以使用该协议收集的其他可量化数据 14,32,33,34,35,36。

图 1：示例数据表显示了在现场可以收集的数据。 收集的具体数据将根据项目目标而有所不同。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：用作优惠券的照片。 拍摄照片作为事件的凭证对于报告目的至关重要。当多个物种具有相似特征时，需要具有不同识别特征的照片。这种在佛罗里达州发现的 Anthidium maculifrons 可以根据其 scape 和 head 上的黄色与该属的其他 Anthidium maculifrons 区分开来。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：在可重复密封的样品袋中打孔。 可以改变可重复密封样品袋中孔的位置，以曝光感兴趣的特定身体部位，用于照片或基因样本。在这张合成照片中，（A） 蜜蜂的头部、（B） 腹部和 （C） 腿暴露在照片中。一旦蜜蜂被限制并且无法移动，它通常会休息并可以定位以进行微距照片。（D） 当蜜蜂处于这些位置时，也可以采集基因样本。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：蜜蜂的收集袋显示一个角对角切割。 如果想仔细观察蜜蜂的头部，袋子一角的切口会根据蜜蜂的头部大小而有所不同。花粉甚至花蜜分泌物可能会在袋子中找到，以备将来识别花粉。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：蜜蜂可重复密封样品袋的图像。 为避免在标记蜜蜂时被蜇伤，可以在袋子上打一个孔，并将 （A） 胸部放置在孔下方。（B） 根据蜜蜂的大小，也可以在腹部做标记。（C） 或者，也可以将蜜蜂从角孔中释放出来，并在胸部压缩以进行标记。这种技术会增加被蜇伤的机会，但似乎可以最大限度地减少笔涂抹。可以使用独特的颜色/编号来区分个体。（D） 未来重新捕获的标本可以通过可重新密封的样品袋快速轻松地拍照并放行。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：使用该协议评估的形态学特征。 还可以处理样本来观察和记录本表中未表示的许多特征（例如，Tergite/Sternite 形状、总长度、重量、齿数、翼脉、皮间距离等）。 请点击此处下载此表格。

讨论

该协议概述了一种安全处理和检查稀有蜜蜂的现场方法，其最终目标是获得所需的非致命样本或凭证信息，并在原始捕获点将重点个体安全释放回野外。与其他采集方法（例如使用小瓶）相比，该方案的好处是可以安全地限制标本，以便仔细检查关键特征和自信的识别，从而限制对昆虫和研究者的伤害。相反，与其他方法^18,19 一样，该方案不需要麻醉标本;它可以以最少的处理快速取样和放行。可重复密封的样品袋成本低、易于获得、重量轻、非常便携且可回收，使其成为离心管的绝佳替代品。由于它们缺乏某些替代品（例如猎鹰管或其他硬质容器）的刚性，因此在处理活体昆虫标本时必须格外小心。如果要将整个标本作为凭证，将其放在坚固的外壳中将减少对标本的潜在损坏。

对于使用这种方法的研究人员来说，具有处理蜜蜂和/或其他昆虫的经验是有益的，因为当标本在袋子中时，对标本施加太大的压力可能会导致受伤或死亡。为了获得更多处理蜜蜂的经验，新手研究人员应该使用更常见的物种（例如蜜蜂）来练习此协议。练习将有助于最大限度地减少对昆虫的伤害或死亡。需要注意的是，根据焦点分类单元的不同，这种方法可能存在局限性。特定分类群的缩小可能需要使用更昂贵和专业的宏观摄影设备和/或使用场显微镜，因为它们的特征可能无法用该程序中列出的材料进行分离和拍照，目标越小，就越难获得足够的图像³⁷。此外，在需要无法接近的身体部位（例如舌头、生殖器等）的情况下，可能需要使用其他识别方法。生殖器是昆虫最有用的诊断特征之一，它在不同物种之间可能变化很大，但在物种内部可能比较稳定^38,39。在这种情况下，可能需要使用致命方法，例如解剖。然而，对于难以识别的物种，在野外收集⁴⁰ 后，可以使用小的、非致命的遗传样本进行鉴定，并且这里描述的方法可用于收集此类样本。统计模型也正在开发中，以帮助将成像和 DNA 测序关联起来进行昆虫鉴定⁴¹。

此处介绍的方法的另一个局限性涉及执行此方案时被蜇的可能性，尤其是在袋子上开孔时。然而，该协议将被蜇伤的可能性降至最低;作者在处理标本时很少被标本袋蜇伤。还应该注意的是，某些种类的蜜蜂、甲虫和黄蜂已经能够用它们的下颌骨切割袋子，因此在确定这种方法是否适用于感兴趣的分类群时应小心，在这些情况下，建议使用更厚的塑料袋或其他方法。在所有情况下，用户都应尽量减少使用一次性塑料，并尽可能回收利用。

制定该方案的重点分类群是蓝色卡拉米亚蜂 Osmia calaminthae （膜翅目：Megachilidae），其大小约为 10-11 毫米，大小为³²。自从开发这种方法以来，作者已将其用于各种其他大小的其他膜翅目动物，包括较大的 Bombus 物种（膜翅目：Apidae）和 Caupolicana 物种、 C. electa 和 C. floridana （膜翅目：Colletidae）。 Caupolicana electa 可以在 18-23 毫米之间变化，而 C. floridana 可以在 16-18 毫米之间变化³³。为了帮助最大限度地减少对高危、濒危或所列物种的任何负面影响，建议先在密切相关和/或共同的替代品上尝试，以帮助获得经验和提高熟练程度。蜜蜂和其他昆虫的外骨骼可能会有所不同，不太健壮的标本应小心处理。在研究较小或较软的昆虫体的情况下，这种方法可能还不够。用户必须确定此方法的哪些部分适合其焦点分类单元。

除了限制现场收集的生物体进行鉴定的主要目标之外，该协议还可以修改以执行需要安全限制蜜蜂的各种研究相关任务。例如，可以在现场称量生物体，同时在可重复密封的样品袋中称量生物体。研究人员还可以在昆虫受到限制的情况下使用卡尺对标本进行各种测量。例如，可以使用体型⁴² 来估计蜜蜂的归巢能力;我们的方法可以帮助获取有助于此类估计的数据。同样，研究人员可以在标本正后方放置尺子/比例尺和/或色卡并拍摄它，以测量关键形态特征，而不是使用卡尺，以便在以后处理图像时测量关键形态特征。这种方法的未来应用可以利用人工智能和机器学习的进步。使用智能设备可以简化现场和实验室的识别，从而最大限度地减少处理时间和对标本的压力。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos