微流体评估血小板功能

摘要

可以评估血流下的血小板功能，并且可以使用微流体设备模拟止血复苏，这在创伤和输血医学中具有应用。

摘要

微流体结合了模拟脉管系统的生理相关底物和流动，因此是研究血栓形成和止血方面的宝贵工具。在模拟动脉血流的高剪切环境中，微流控测定有助于研究血小板功能，因为富含血小板的血栓形成于流道的局部狭窄区域。利用允许小样本量的设备还可以帮助评估体积受限的患者样本或动物模型在流中的血小板功能。研究创伤患者样本或血小板产品输注后的样本可能有助于指导血小板功能至关重要的患者群体的治疗策略。在该模型中也可以研究通过药物抑制血小板的影响。该协议的目的是建立一个微流体平台，该平台结合了生理流动、生物表面和相关止血机制，以评估血小板功能，对创伤诱导的凝血病和输血医学的研究具有意义。

引言

创伤是导致全球死亡和残疾的主要原因。严重损伤通常并发于一种独特的内源性止血和血栓形成障碍，称为创伤性凝血病 （TIC）¹。血小板在 TIC 中起关键作用，它们被描述为同时具有适应性和适应不良功能²。损伤后血小板功能障碍的机制尚不清楚，迫切需要更好地了解细胞反应，以指导改进复苏和治疗的发展。关于受伤后血小板功能的另一个棘手问题是创伤患者血小板功能当前读数可靠性的不确定性。

多项研究表明，即使是轻度受伤的患者，没有已知的临床出血表型，使用常规血小板功能测试（如凝集测定法）也会出现血小板功能异常 ^3,4。然而，在损伤情况下评估血小板功能的凝聚物测定法的局限性包括缺乏生理相关的损伤表面、激动剂刺激的还原方法、使用全血阻抗凝聚测定法稀释样本、使用光透射聚集测定法进行血浆分离以及停滞样本评估。此外，在损伤的情况下，血小板功能的这种敏感性是否代表真正的细胞功能障碍或测量伪影，例如基线电阻抗增加，仍不清楚²。因此，在创伤背景下研究相关的血小板功能对于理解 TIC 至关重要，并且在该领域有很大的创新和改进空间。

传....

研究方案

所有研究均按照机构指南进行。获得了匹兹堡大学人类研究保护办公室的批准，并获得了健康人类志愿者的知情同意。

1. 微流控器件制备

1. 要制造设备的 PDMS 部分，请通过计算机数控 （CNC） 微加工使用黄铜准备一个母模。
   注意：根据通道尺寸，可以使用光刻技术创建母模。该协议中使用的设备包括八个平行的微机械通道，宽约 480 μm，设备入口和出口高 140 μm，设备狭窄处高 40 μm，进出狭窄区域的斜坡长度约为 0.3 mm。通道长度约为 6 mm。
2. 获得母模后，将硅橡胶基（从弹性体套件中获得）倒入称重盘中。添加有机硅固化剂（从弹性体套件中获得），它有助于有机硅聚合物链的交联，以 10：1 的比例（碱剂）将液体 PDMS 转化为耐用且灵活的固体，并充分搅拌混合物。
3. 将模具放入培养皿中，将未固化的 PDMS 倒入模具上。将培养皿放入真空干燥器中 30 分钟以去除气泡。
4. 将 PDMS 放入设置为 70 °C 的烘箱中 90 分钟，完成母模中的 PDMS 固化。
5. PDMS 完全固化后，使用剃须刀片或手术刀切出微流控石膏。在通道边缘打孔（两侧直径为 1.5 mm）。
6. 使用实验室胶带清洁载玻片的表面和微流体铸件的蚀刻面。根据需要使用压缩空气清除残留的碎屑。

结果

使用该方法后的微流体实验应显示流道狭窄区域形成富含血小板的血栓（图 1）。 图 1A 说明了功能性血小板在通道的狭窄区域形成血栓以阻止血液流经通道的代表性结果。在实验期间拍摄的动力学图像的平均荧光强度 （MFI） 曲线说明了生长血栓中血小板掺入的滞后、生长和平台期（图 2A、C.......

讨论

上述协议有一些关键步骤来确保实验的可靠性和可重复性。首先，应仔细考虑荧光抗体。用于检测样品中血小板的抗体不应阻断糖蛋白 Ib （GPIb） 血小板受体的功能。实验之间尽可能进行批次匹配对于确保荧光信号的可重复性也至关重要。该方案的另一个关键步骤是尽可能使用无菌耗材和溶液以及过滤样品。在实验前立即过滤血液样本将防止大于通道尺寸的碎片或血小板.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626