体内叶接种：评估杂交无性系在杨树育种茎溃疡病中的抗病性的替代方法

摘要

我们提供了一个分步方案，用于使用 体内 叶接种方法评估杨树对茎溃疡病病原体的抗性。该方法特别适用于我国杨树育种后代中 Cytospora chrysosperma 和 Botryosphaeria dothidea 溃疡病抗性的大规模评估。

摘要

由病原体 Cytospora chrysosperma （Pers.） Fr.） 和 Botryosphaeria dothidea （Moug. ex Fr.） Ces. 引起的茎溃疡病。& De Not. 是中国杨树种植园的两种主要森林病害，有时可以破坏所有的杨树幼苗或严重损害成熟的杨树林。杂交育种是控制和管理树木病害的最直接、最有效的方法。然而，基于 体外 茎接种评估抗病性或选择抗病性系效率低、耗时且成本高，限制了杨树茎溃疡病杂交育种的发展。在这项研究中，我们提出了一种替代方法，通过 体内 接种来评估对茎溃疡病病原体的抗病性。该方法使用的测试材料可以在 1 年生的杨树树苗或温室或田间多年生杨树的一年生枝条上。这种替代方法的关键步骤是接种叶子的选择：第 5-7^片 新成熟的叶子可能是最合适的。叶片接种法的第二个关键步骤是通过针刺在植物叶片上留下伤口，提供足够的病变来测量疾病的严重程度。对于杨树育种早期产生的足够数量的叶片，这种 体内 叶接种有助于快速、准确和大规模地筛选抗病杨树无性系以阻止溃疡病病原体。此外，这种叶接种方法也将作为筛选茎溃疡病病原体 C. chrysosperma、 B.dothidea 或其他杨树茎溃疡病病原体病型的有效方法。

引言

杨树茎溃疡病，主要由两种坏死营养病原体引起，即 Cytospora chrysosperma （Pers.） Fr. 和 Botryosphaeria dothidea （Moug. ex Fr.） Ces.严重威胁到中国东北、北方和西北（三北）杨树种植园的发展和生存。杂交育种是控制和管理树木病害的最直接、最有效的方法;然而，与高产、速生或其他杨树杂交无性系的育种进展相比，杨树溃疡病的抗性育种研究很少。仅报道了有限的抗病杂交育种研究 ^1,2,3，^并且在杨树造林中没有培养出抗溃疡病杂交无性系。

常规杂交育种的关键步骤是基于杂交后代的表型获取进行克隆选择。然而，获取病理表型 （pathotypes） 是一个耗时、费力、累人、昂贵且依赖专家的过程。对于木本植物来说，由于其生命周期长、生长缓慢和体型庞大，导致耗时、耗力和耗经济的性质更具挑战性。例如，在杨树中，杂交后代的溃疡病抗性筛选是在杂交后 5-7 年通过常规体外茎接种方法进行的 ^1,2,3

研究方案

1. 溃疡病菌菌培养

1. 制备用于真菌菌株的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA;马铃薯提取 6.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 20.0 g）培养基;将上述材料溶于高达 1000 mL 的水中，在 100 °C 下完全溶解培养基 10 分钟。
2. 将 PDA 培养基倒入 25 mL 试管中（每管含 15.0 mL）;将所有试管在 121.1 °C 下消毒 30 分钟。将培养基倒入培养板（直径 9.0 cm）中，并在室温 （RT） 下冷却板。
3. 将真菌病原体的菌丝体切成~0.5 cm的方形立方体，该菌丝体在PDA培养基中于28°C培养7天;接种 PDA 板中心的真菌立方体（菌丝体侧面面向培养基）。
4. 将真菌病原体在恒温培养箱（28°C，避光）中培养 7-10 天。
5. 将含有真菌菌丝体的 PDA 培养基切成方形立方体（边长 1.0-1.2 厘米）。

2. 杨树材料的制备

1. 对于 1 年生的杨树无性系（> 3 个月栽培），选择主枝新成熟、完全伸展的叶子（总是第 5-7^片 叶子，从树苗/树枝的顶部开始）作为接种材料，确保它们没有病虫害和机械损伤。
2. 对于多年生杨树杂交无性系的 1 年生枝条（培养 2 个....

讨论

该方案为杨树溃疡病抗性病原体提供了一种快速有效的接种方法，适用于需要大规模抗病性筛选的研究领域，如杨树溃疡病抗性杂交育种和茎溃疡病病原体的致病性筛选。

该方法的第一个关键点是通过新成熟的叶子接种而不是成熟的茎/枝来评估抗病性。因此，采用叶接种法在杨树杂交育种的 1-2 年内可以进行茎溃疡病抗病性系的选择，与茎接种途径.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil	Biosharp	BS-QT-027B
C. chrysosperma isolate	China Forestry Culture Collection Center	CFCC86775	Separation and preservation by our laboratory
Cytospora chrysosperma	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry	NCBI accession number: MK994101 for rRNA-ITS and MN025273 for EF1α gene   CGMCC number:40575	Separation and preservation by our laboratory
Epson Perfection V370 Photo	Epson	V370	Scanner; Scan the leaves into image
PDA (Potato Dextrose Agar)	Solarbio	P8931	Provide nutrition for fungal growth
PE plastic film			To fix fungi on the leaves
Populus alba var. Pyramidalis	Plant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry		Cultivated by our laboratory
SPSS	IBM		Data analysis software
Thermostatic incubator	Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd	KTD-6000	Provide an environment for fungal growth
Tough TG-6 camera	OLYMPUS		To take photos of diseased leaves