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本文介绍了小鼠中常用线性轨道虚拟现实 (VR) 范式的实验程序,以及通过测试 Y 形信号鉴别任务来确定运行复杂 VR 任务的可行性。
虚拟现实 (VR) 与头部固定相结合,越来越多地用于行为神经科学研究,因为它允许在头部固定的小鼠中进行复杂的行为分析。这实现了精确的行为记录,同时结合了需要头部固定的各种神经生理学技术,以最大限度地减少神经记录期间与运动相关的信号噪声。然而,尽管 VR 的使用越来越多,但关于如何实施它的详细方法的公开数据很少。在这项研究中,开发了一种训练方案,据此训练雄性和雌性 C57B16/J 小鼠沿着虚拟线性走廊奔跑,在多次训练中,其长度从 1-3 m 增加。在此基础上,本研究使用 Y 迷宫范式调查了小鼠在 VR 中执行复杂行为的可行性。该任务需要从 Y 迷宫中的选择点导航到带有黑色墙壁的手臂。在达到连续两天正确率等于或大于 70% 的标准后,小鼠的感官辨别能力越来越困难。 这些发现提供了有关在 VR 中成功训练小鼠有用的方法的重要细节,并表明小鼠在导航 Y 迷宫时表现出学习能力。所提出的方法不仅提供了对基于 VR 的分析中训练持续时间的见解,还强调了探测小鼠复杂行为的潜力,为更全面的神经科学研究开辟了途径。
由于头部固定,虚拟现实任务已成为一种强大的小鼠行为评估方法,它允许机械稳定性,而这在行为自由的小鼠中会受到损害1。这种方法可以减少电生理记录 2,3 和光学成像 4,5,6,7 中的运动伪影。它还有助于实现可重复的行为8 (repeatable behaviors) 和精确的眼动追踪9 (precise eye-tracking)。在实验设置中,鼠标固定到位并位于空气支撑的球形跑步机上。该设备允许在 VR 环境中对视觉引导行为进行复杂的探索。当鼠标在跑步机上移动时,它的运动与它在虚拟景观中的导航无缝同步,虚拟景观直观地描绘在鼠标周围的屏幕上。
本研究的目的有两个:解决实验行为神经科学中的关键挑战,并为该领域方法的进步做出贡献。首先,尽管 VR 在学术研究中的使用有所增加 10,11,12,但仍然明显缺乏全面的方法和训练方案,阻碍了新研究人员采用这项技术。主要目标是通过为线性轨道范式描述详细的训练方案来填补这一空白,如之前的研究所描述的那样 13,14,15。使用市售系统来描述这些作程序。作为免责声明,这些程序指南具有特定于此系统的组件;但是,有关此协议的通用性的讨论,请参阅讨论。目的是概述行为程序、执行这些程序的典型时间表以及训练小鼠在简单的线性轨道上跑步的成功率。
其次,仍然缺乏关于在小鼠中实现这种范式中复杂迷宫任务的文件。已在大鼠11 中开发了复杂的虚拟检测。然而,相比之下,小鼠的视力降低16 ,并且在复杂任务中通常表现更差17。虽然一些研究侧重于特定任务,例如证据积累或空间新颖性18,但这里的重点是阐明小鼠在 VR 环境中参与决策范式所需的训练方法。为了应对这一挑战,设计了一项信号辨别任务,其中小鼠的任务是学习将奖励组的颜色/亮度(黑色与白色)与奖励相关联,通过在 Y 迷宫的选择点选择黑色手臂来实现,正确的手臂在每次试验中随机分配。这项任务旨在要求与虚拟线索进行交互,并提供对小鼠感知辨别能力的洞察。
总之,本研究通过提供在小鼠中使用 VR 范式的综合训练方案并阐明该框架内复杂决策任务的方法,解决了实验行为神经科学领域的关键差距。通过利用先前研究的见解和创新实验设计,本研究旨在简化研究实践并促进对行为潜在神经机制的理解。以下部分将更深入地探讨实验程序和结果,并讨论结果。
所有涉及动物的程序都严格遵守 NIEHS 动物护理和使用委员会制定的协议,确保符合道德标准和福利准则。该研究使用大约 8 周龄的 C57BL/6Tac 小鼠。
1. 头杆植入手术
2. 液体限制
注意:限制饮水会引起小鼠的口渴状态,从而提高它们获得液体奖励的动机。然而,为了确保保护小鼠的健康,必须精心实施20。
3. 系统设置
4. 行为任务
注意:根据行为神经科学的既定方法,制定的任务采用了基于奖励的联想学习技术。通过使用即时奖励来强化特定行为,动物在 VR 的传送功能的帮助下得到有效的训练来执行重复性任务。在虚拟行为框架中,传送功能使老鼠能够在没有与物理作相关的压力的情况下参与任务,同时减少类似现实世界任务所需的设置持续时间。在训练期间,在实验环境中使用暗红色的头顶照明。建议采取这种预防措施,因为小鼠对红光的视觉感知敏感性降低,与使用白光相反,这减轻了对它们对虚拟现实 (VR) 屏幕感知的潜在干扰22。
这项试点研究旨在概述在两个不同任务中有效训练小鼠的方法:简单的走廊和复杂的决策任务(Y 迷宫视觉识别任务)。这些数据是建立 VR 行为训练时间指南的基础。
程序步骤首先概述了 图 1 中头杆的手术植入。这种植入物用于在行为评估期间稳定小鼠的颅骨,从而提高神经记录的精度,尤其是在与电生理学或成像技术结合使用时。
图 2 和图 3 说明了实验系统的硬件组件和设置。图 2 详细说明了使用培养皿喷泉方法的输水系统。这包括将 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝下固定在笼子地板上,将较小的 35 mm x 10 mm 培养皿凹面固定在较大培养皿的中心,并将另一个 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝上放置在较小培养皿的顶部,作为储水器。仔细调整上盘的高度,以防止被垫料污染,同时确保小鼠易于取水。
图 3 显示了系统硬件和鼠标定位指南。 图 3A 描绘了 VR 设置,该设置具有一个六屏幕阵列,球形跑步机位于中央。 图 3B 显示了鼠标在跑步机上的最佳位置,头部处于自然位置,所有四个爪子都与表面接触。 图 3C 比较了鼠标相对于头杆的正确和错误位置,强调鼠标的中矢状面应居中,而不是与头杆本身对齐。
图 4 以折线图的形式显示了奖励获取曲线,说明了 VR 中 1 m、2 m 和 3 m 狭窄走廊的预期学习期,这些时间基于预定义的进展参数。它描述了小鼠在相应轨道长度上的平均速度,表明速度逐渐增加,这是与难度增加相称的任务学习和改进的证据。还显示了一个条形图,说明了小鼠达到线性轨迹标准所需的平均天数,以及一个显示每个轨迹长度的平均速度的条形图。在此之后,还说明了小鼠学习的线性跟踪任务的渐进阶段。这些任务旨在复制学术文献中建立的方法,同时确保小鼠的学习曲线可行,促进它们通过各个级别取得进步。
最后, 图 5 提供了与 Y-Maze 任务相关的数据。该图说明了任务的渐进性质,首先是直接区分实心黑色和白色手臂。这个初始阶段作为基础步骤,建立小鼠区分对比视觉线索的能力。任务的后续级别通过向每个手臂添加额外百分比的对比色来引入越来越复杂,从而进一步挑战小鼠的辨别能力。任务难度的逐渐增加表现为从纯黑色和白色手臂过渡到由一种颜色的 90% 和另一种颜色的 10% 组成的手臂。值得注意的是, 图 5 中提供的数据表明,虽然区分准确性随着每个级别的进展而提高,但一些小鼠始终表现出视觉辨别能力的阈值,最高达到 80%/20% 的白人/黑人辨别能力。这一观察强调了小鼠在 Y-Maze 任务背景下视觉辨别能力固有的局限性,为任务的可行性和受试者的认知能力提供了有价值的见解。随后,详细介绍了 Y 迷宫跟踪任务的渐进阶段,这些阶段旨在与文献中的既定方法保持一致。这些阶段确保了小鼠的可行学习曲线,支持它们逐步通过各个级别。
图 1:头杆植入手术说明。 (A) 切口部位标记在小鼠的颅骨上。(B) 螺钉应植入前囟略下方额间缝线左侧 1 毫米处,额间缝线右侧略高于 lambda 上方 3 毫米处。(C) 头杆应沿额间缝合线放置。(D) 在头杆植入物上涂抹牙科粘接剂。(E) 应用牙科粘固剂后头杆的实际可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:使用培养皿喷泉方法的输水系统。 将 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝下固定在笼地板上。一个较小的 35 mm x 10 mm 培养皿位于较大的培养皿的中心,另一个 60 mm x 15 mm 培养皿将凹面朝上放置在顶部作为储液器。这种设置确保了水不受床上用品的污染,并且可供老鼠使用。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3:鼠标指南的系统硬件和定位。 (A) 这将显示所使用的 VR 设置。使用了六屏设置,球形跑步机位于中间。(B) 球形跑步机上鼠标最佳放置的侧视图。鼠标头处于自然位置,而所有四只爪子都在球形跑步机上。(C) 鼠标相对于头杆的正确和错误放置的俯视图。为了正确放置,鼠标的中矢状面应居中,而不是头杆本身。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 4:线性轨迹数据。 (A) 提供的数据描述了每 30 分钟试用期内收集的每日奖励。一旦小鼠在连续 2 天内平均每分钟达到 2 个奖励,总共 60 个奖励(阈值),它们就会发展到更长的轨迹长度。(B) 随着小鼠熟练掌握任务,它们的速度逐渐增加,表明奖励强化的有效性。该图说明了轨道上每只鼠标的平均每日速度(以 cm/s 为单位),描绘了学习行为的线性进展。(C) 此条形图说明了每只鼠标熟练掌握单个轨迹长度所花费的持续时间,并描述了每个轨迹长度的相应平均值和标准误差。(D) 该条形图显示了每只小鼠在不同轨迹长度上达到的平均日速度的平均值和标准误差。近乎线性的进展表明跑步速度的习得性增强。(E) 这说明了线性跟踪任务的进展,该任务需要连续 2 天的 60 个奖励的试用日,然后才能升级到更长的迷宫版本。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5:Y 迷宫数据。 (A) 这显示了在 Y 迷宫进程的不同阶段获得的奖励分布。该分析仅关注完成线性轨道所有阶段的四只小鼠的子集,从而确保男性和女性参与者的公平代表。(B) 这种视觉表示说明了 Y-Maze 任务的各个阶段,其中小鼠在连续两天获得 70% 正确选择后前进。 请单击此处查看此图的较大版本。
本研究采用综合方法来调查小鼠在 VR 环境中的行为反应,重点是外科手术的实施、液体限制方案、系统设置和行为任务。这些发现通过提供程序细节、训练时间框架和成功率为该领域做出贡献。这将使 VR 程序在小鼠中更有效地采用,并促进有兴趣在研究中使用该程序的实验室的规划和实施。
头杆的手术植入对于促进 VR 环境中的头部固定行为实验至关重要。通过仔细遵循既定方案并提供适当的术后护理,确保了头杆的成功整合,同时最大限度地减少了对动物健康和行为的不利影响。此外,实施了液体限制方案以调节饮水量并维持小鼠的水合作用和口渴水平。逐渐适应过程和定期取水对于确保动物的福利同时促进行为任务的执行至关重要。
VR 行为系统的设置涉及硬件和软件组件的集成,以便为小鼠创建身临其境的虚拟环境。利用完全沉浸式的虚拟显示器、液体奖励系统、聚苯乙烯泡沫塑料球作为球形跑步机和头架,可以精确控制实验条件和数据采集。行为任务,包括线性跟踪和 Y 迷宫范式,经过精心设计,以研究小鼠行为的关键方面,例如运动、决策和奖励处理。
尽管尽了最大努力优化实验程序,但在研究过程中遇到了一些挑战。单个小鼠反应的可变性以及与硬件和软件集成相关的技术问题对数据收集和分析提出了挑战。此外,对液体限制方案的依赖需要仔细监测动物的水合状态并相应地调整实验程序。有时,老鼠在被放在球上时会挣扎,不能从奖励喷口喝水,或者冻结并且无法在球上奔跑。尽管其中一些挑战可能是暂时的,但监测小鼠以确保它们在前进过程中没有遇到障碍至关重要。与同龄人相比未能表现出进步的小鼠应退出研究。一项类似的实验将 55 只小鼠中的 4 只由于无法学习范式25 而被移除。在对小鼠的体重、进入奖励嘴饮水的能力以及在球上的位置以确保不存在潜在问题后,连续 5 天在球上表现出持续不动的小鼠被排除在研究之外。在这些情况下,由研究人员自行决定采取何种策略来有效恢复研究。
这些训练方案旨在逐步挑战小鼠,同时确保它们熟练执行行为任务。从线性轨道进展到 Y 迷宫范式的标准基于小鼠满足预定性能阈值的能力,例如实现连续几天的成功试验和获得奖励。严格的训练方案的实施使我们能够评估小鼠的行为能力和对日益复杂任务的适应性。这些精心构建的协议为行为神经科学领域的研究人员提供了一个强大的框架,提供了一种系统的方法来评估和训练动物以适应不同的实验范式。通过概述明确的进步标准,研究人员可以有效地衡量实验对象的学习曲线并相应地策划训练范式。此外,这种方法促进了实验的可重复性和标准化,促进了比较分析并促进了对动物模型中认知过程和学习机制的理解。
在为小鼠设计 VR 范式时,认识到有关任务复杂性和训练进度的可用方法范围至关重要。该协议为构建实验设计提供了广泛的框架,但仍然由研究者根据研究的需要定制特定方面,例如奖励交付、偏差控制、刺激类型、任务进展和系统参数。 例如,一些研究选择了一种更简化的方法,专注于即时任务参与。一个例子是 Krumin 等人,他们实现了一个单一的、一致的 T 迷宫任务,而不是在不同任务之间采用渐进式学习方案。相比之下,其他研究提供了不同的试验设计组成部分,例如刺激强化策略和听觉线索。该研究利用听觉反馈作为对错误试验的惩罚,并且只提供水作为对正确试验的奖励26。相反,Zhao 等人使用 10% 蔗糖溶液作为对正确试验的奖励,并且没有对错误试验进行任何形式的惩罚27。相反,他们专注于通过反偏见训练等方法减少错误反应,其中包括增加从动物先前的选择改变提示方向的可能性,并调整每日饮水量以提高动机。实验设计的差异,例如整个任务中存在空间线索,可能导致对神经编码的不同解释,Zhao 等人发现后顶叶皮层细胞选择性由轨迹和空间偏好解释,这与 Harvey 等人观察到的选择依赖性激活序列形成鲜明对比27,28.需要注意的是,使用的特定硬件包括六个 LCD 显示器、一个可伸缩的舔嘴和一个气垫泡沫塑料球形跑步机。不同实验室的虚拟现实系统存在许多差异,包括投影仪29 与计算机显示器的使用、非球形跑步机30 的使用以及固定10 与可伸缩的舔嘴的使用。
总之,这项研究为小鼠在 VR 环境中的行为反应提供了有价值的见解,并证明了采用沉浸式技术研究复杂行为的可行性。未来的研究工作可能侧重于完善实验方案、探索决策过程背后的神经机制以及将研究结果转化为临床应用。通过继续推进对小鼠行为的理解,科学家可以进一步阐明健康和疾病中复杂行为背后的神经回路和认知过程。
作者没有任何利益冲突或相互竞争的经济利益。
这项研究由美国国家环境健康科学研究所 (ZIC-ES103330) 资助。特别感谢 Phenosys 的 K. Krepinksy 在系统的硬件和软件属性方面的帮助,感谢牛津大学的 T. Viney 在行为范式方面的帮助,最后感谢 NIH 的 G. Vargish 对他的飞行员程序和手术方法的指导。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32) | Protech International | 8L0X3905202F | For Added Headbar Stability |
Bupivocaine | Hospira | NDC:0409-1162-19 | Local Anesthetic |
Buprenorphine | Wedgewood Pharmaceuticals | SKU: BUPREN-INJ010VC | Analgesia |
Buzzers | Wahl | 1565q | For Shaving Surgical Region |
Drill and microinjection robot | Neurostar | 17129-IDA | Stereotaxis |
GLUture | Zoetis | 32046 | Surgical Adhesive |
Head-bar Implant | Luigs-Neumann | 130060 | Mouse Head Implant |
Heating Pad (Lectro-Kennel) | K&H Manufacturing | 100212933 | Post-operative |
Hemostats | World Precision Instruments | 501291 | Surgical Tool |
Hydrogen Peroxide | Swam | L0003648FB | Cleaning Agent |
Isoflurane | Dechra | B230008 | Surgical Inhalation Anesthetic |
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments | Eagle Eye Anesthesia Inc. | Model 50 Anesthesia | Surgical Device |
Metabond | Parkell | CB-S380 | Adhesive Cement |
Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Surgical Tool |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Surgical Oxygen |
Povidone-Iodine Swabstick | Dynarex | g172095-05 | Surgical Tool |
Saline | Hospira | NDC:0409-1966-02 | Hydration Agent |
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips) | Puritan | 25-806 2WC | Surgical Tool |
Sucrose | Fisher Chemical | CAS 57-50-1 | Primary Reinforcer/Motivator/Reward |
Tweezers | World Precision Instruments | 504505 | Surgical Tool |
Virtual Reality System | PhenoSys | JetBall-TFT | The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors. |
White petrolatum lubricant eye ointment ointment | AACE Pharmaceuticals | NDC:71406-124-35 | Eyelube |
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