小鼠头部固定虚拟现实的行为训练程序

摘要

本文介绍了小鼠中常用线性轨道虚拟现实 （VR） 范式的实验程序，以及通过测试 Y 形信号鉴别任务来确定运行复杂 VR 任务的可行性。

摘要

虚拟现实 （VR） 与头部固定相结合，越来越多地用于行为神经科学研究，因为它允许在头部固定的小鼠中进行复杂的行为分析。这实现了精确的行为记录，同时结合了需要头部固定的各种神经生理学技术，以最大限度地减少神经记录期间与运动相关的信号噪声。然而，尽管 VR 的使用越来越多，但关于如何实施它的详细方法的公开数据很少。在这项研究中，开发了一种训练方案，据此训练雄性和雌性 C57B16/J 小鼠沿着虚拟线性走廊奔跑，在多次训练中，其长度从 1-3 m 增加。在此基础上，本研究使用 Y 迷宫范式调查了小鼠在 VR 中执行复杂行为的可行性。该任务需要从 Y 迷宫中的选择点导航到带有黑色墙壁的手臂。在达到连续两天正确率等于或大于 70% 的标准后，小鼠的感官辨别能力越来越困难。 这些发现提供了有关在 VR 中成功训练小鼠有用的方法的重要细节，并表明小鼠在导航 Y 迷宫时表现出学习能力。所提出的方法不仅提供了对基于 VR 的分析中训练持续时间的见解，还强调了探测小鼠复杂行为的潜力，为更全面的神经科学研究开辟了途径。

引言

由于头部固定，虚拟现实任务已成为一种强大的小鼠行为评估方法，它允许机械稳定性，而这在行为自由的小鼠中会受到损害¹。这种方法可以减少电生理记录 ^2,3 和光学成像 ^4,5,6,7 中的运动伪影。它还有助于实现可重复的行为⁸ （repeatable behaviors） 和精确的眼动追踪⁹ （precise eye-tracking）。在实验设置中，鼠标固定到位并位于空气支撑的球形跑步机上。该设备允许在 VR 环境中对视觉引导行为进行复杂的探索。当鼠标在跑步机上移动时，它的运动与它在虚拟景观中的导航无缝同步，虚拟景观直观地描绘在鼠标周围的屏幕上。

本研究的目的有两个：解决实验行为神经科学中的关键挑战，并为该领域方法的进步做出贡献。首先，尽管 VR 在学术研究中的使用有所增加 10,11,12，但仍然明显缺乏全面的方法和训练方案，阻碍了新研究人员采用这项技术。主要目标是通过为线性轨道范式描述详细的训练方案来填补这一空白，如之前的研究所描述的那样 13,14,15。使用市售系统来描述这些作程序。作为免责声明，这些程序指南具有特定于此系统的组件;但是，有关此协议的通用性的讨论，请参阅讨论。目的是概述行为程序、执行这些程序的典型时间表以及训练小鼠在简单的线性轨道上跑步的成功率。

其次，仍然缺乏关于在小鼠中实现这种范式中复杂迷宫任务的文件。已在大鼠¹¹ 中开发了复杂的虚拟检测。然而，相比之下，小鼠的视力降低¹⁶ ，并且在复杂任务中通常表现更差¹⁷。虽然一些研究侧重于特定任务，例如证据积累或空间新颖性¹⁸，但这里的重点是阐明小鼠在 VR 环境中参与决策范式所需的训练方法。为了应对这一挑战，设计了一项信号辨别任务，其中小鼠的任务是学习将奖励组的颜色/亮度（黑色与白色）与奖励相关联，通过在 Y 迷宫的选择点选择黑色手臂来实现，正确的手臂在每次试验中随机分配。这项任务旨在要求与虚拟线索进行交互，并提供对小鼠感知辨别能力的洞察。

总之，本研究通过提供在小鼠中使用 VR 范式的综合训练方案并阐明该框架内复杂决策任务的方法，解决了实验行为神经科学领域的关键差距。通过利用先前研究的见解和创新实验设计，本研究旨在简化研究实践并促进对行为潜在神经机制的理解。以下部分将更深入地探讨实验程序和结果，并讨论结果。

研究方案

所有涉及动物的程序都严格遵守 NIEHS 动物护理和使用委员会制定的协议，确保符合道德标准和福利准则。该研究使用大约 8 周龄的 C57BL/6Tac 小鼠。

1. 头杆植入手术

1. 手术准备
   1. 为自己的队列获得所需数量的小鼠，理想情况下将它们单独饲养，以尽量减少对头杆植入物的干扰，尽管这是可选的¹⁹。这项研究使用了三只雄性和三只雌性小鼠的样本量（最初是平衡的，但一只雄性在训练早期因未能带球跑动而被排除在外）
   2. 获取 材料表中指定的材料，根据研究设计的具体情况进行调整。
   3. 在获取小鼠后，指定个体标识符并应用尾巴纹身或耳孔打孔以确保明确识别。建立全面的日志，以根据限水程序的要求系统地记录它们的重量。
2. 麻醉管理
   1. 确保所有手术器械都可用，包括合适的注射器、加热垫、金属器皿（如镊子、微型剪刀和止血钳）、碘溶液、眼部润滑剂以及用于盐水和过氧化氢的烧杯。为确保无菌条件，请使用高压灭菌器对所有手术设备进行消毒，并对所有手术工具进行消毒。
   2. 在进行手术之前，对小鼠进行精确的体重测量，并将加热垫激活至34°C。 将所有必要信息记录在机构的实验室/外科笔记本中。验证氧气和异氟醚罐液位的充足性，并确认所有必要材料的可用性，以促进不间断的外科手术。
   3. 将鼠标切碎并将其放入连接到蒸发器的鼻锥中，该鼻锥专为接受 4% 异氟醚和 3 L/min 氧气流速的小动物设计以诱导麻醉。使用清除剂捕获任何可能有害的废气（推荐）。
   4. 当小鼠在鼻腔下方时，将 Petroleum 眼科兽药膏涂抹在小鼠的眼睛上，以防止眼部干燥。最初将一滴滴剂涂抹在每只眼睛上，然后根据需要重新涂抹。通过定期检查始终保持一层这种润滑剂，确保对眼睛的持续保护。
   5. 通过剃掉颅骨将固定在头杆上的区域，准备小鼠头上的手术部位（图 1A）。
   6. 将小鼠的门牙放在鼻锥下方的立体定位装置内，将氧气流速调节至 1 L/min，并从蒸发器中施用 1%-2% 异氟醚。通过调整阀门并在感应鼻锥和立体定位装置之间相应地切换，确保适当的麻醉流程。伸展鼠标的后腿，用力按压脚趾。如果足部没有表现出反射性戒断反应，则表明麻醉有效。每 15 分钟重复一次，同时进行呼吸检查。
   7. 通过在小鼠的耳道内连接手术稳定杆来将小鼠的头部固定到位，从而最大限度地减少手术过程中任何潜在的头部移动。
   8. 在做切口或注射之前，用蘸有碘消毒剂的棉签擦洗头顶剃光的手术区域。从此阶段开始，使用无菌手套来保持无菌条件。
3. 注射给药
   1. 用 0.05G 针头皮下注射 25 mL 布比卡因（局部镇痛剂）到头皮上的手术切口部位。
   2. 用 1G 针头皮下注射 25 mL 生理盐水（水合）到肩胛间区域的一侧。
   3. 用 0.05G 针头皮下注射 25 mL 丁丙诺啡（全身镇痛）到肩胛间区域的另一侧。
4. 露出颅骨
   1. 使用微型剪刀在颅骨额间和鼻间缝合线上方的皮肤上创建一个切口，从眉脊上方开始，一直延伸到枕骨切迹后面（图 1A）。
   2. 使用止血钳压住皮肤的左右皮瓣，露出颅骨。
   3. 使用干燥的棉签去除固定后皮肤褶皱之间的头皮上的结缔组织。
   4. 使用蘸有过氧化氢湿润（但未饱和）的棉签擦洗头皮，确保缝合线可见，并注意不要让过氧化氢沾到周围组织上。
   5. 重复步骤 1.4.3 和 1.4.4,2x-3x，直到前囟和 lambda 都清晰可见，并且头皮得到彻底清洁。
5. 外科螺钉植入术
   1. 将两个螺钉连接到颅骨上，将一个螺钉定位在前囟的后面，另一个定位在 lambda 的前面（图 1B），以最大化牙科粘合剂的表面积并增加头杆的稳定性。将螺钉的位置定位在距前囟指定距离的目标上。确保一个螺钉位于左侧，另一个位于右侧（即前后 （AP） +1.00，内侧-外侧 （ML） -1.00 和 AP -3.00，ML +3.00），确保螺钉之间有足够的空间来容纳头杆的位置并调整坐标和需要。
   2. 钻孔目标位置，确保钻孔仅限于颅骨，不会穿透脑组织。
   3. 使用螺丝刀，将大约一半的螺丝拧入到位。对第二个螺钉重复此作。
6. 连接头杆植入物
   1. 混合牙科水泥并将其施用到头杆的下侧，重点放在凹面，然后沿着颅骨的额缝合线涂抹。
   2. 将头杆放在额间缝合线上，以促进头杆上的牙科粘接剂与缝合线上的牙科粘接剂之间的粘合。用手将其以所需角度牢固地固定到位约 5 分钟，直到它凝固。根据需要涂抹额外的牙科粘固剂。（图 1C-E）
7. 在头杆上重新连接皮肤
   1. 松开止血钳，用镊子将两个皮瓣重新结合在干燥的牙科水泥固定头杆上。使用局部组织粘合剂将头皮的左侧和右侧缓慢地粘合在头杆上，从前切口部位开始，到后切口部位结束，从而将皮肤巧妙地固定在一起。
   2. 让局部组织粘合剂变硬以确认手术区域已重新密封，然后再将鼠标从手术稳定杆和鼻锥中释放出来。
   3. 将鼠标转移到单壳笼中，并将其放在 37.5 °C 的加热垫上。
   4. 仔细监测鼠标是否有任何不适或呼吸不规则的迹象，直到它恢复意识。在鼠标恢复胸骨躺姿、表现出警觉性并且可以走动之前，不要让它无人看管。
   5. 外科手术后，让小鼠休息 1 周。每天监测小鼠以检测和解决体重的任何显着波动。手术后 3 天为小鼠提供醪液以帮助恢复。为防止干扰头杆，请单独容纳这些鼠标。

2. 液体限制

注意：限制饮水会引起小鼠的口渴状态，从而提高它们获得液体奖励的动机。然而，为了确保保护小鼠的健康，必须精心实施²⁰。

1. 在手术后 1 周，确定小鼠的基线体重。
2. 将小培养皿 （60 mm x 15 mm） 凹面的一段向下粘在笼地板上，将较小的培养皿 （35 mm x 10 mm） 凹面向下粘在培养皿平面的中心贴在地板上，另一个小培养皿 （60 mm x 15 mm） 凹陷在中间培养皿的平面上，用作储水器（图 2）。
3. 确保上盘的高度可防止垫料污染，同时让老鼠轻松接触水。使用移液管将每日水允许量添加到水箱中。
4. 第 1 天，为小鼠提供每 100 克体重 15 毫升水的剂量。
5. 第 2 天，为小鼠提供每 100 g 体重 10 mL 水的剂量。
6. 第 3 天，为小鼠提供每 100 克体重 5 mL 水的剂量。在整个研究过程中，小鼠每天应至少摄入 1 mL 水，无论体重如何。
   注意：研究人员可以选择在所有受试者中统一施用最小体积，尽管应仔细考虑进行此类调整。
7. 在整个水分分配研究期间保持一致的剂量，每 100 克体重 5 mL（或如果愿意，均匀分配 1 mL水分）
   注意：当小鼠不进行 VR 实验时（即周末），应每周 随意 给小鼠饮水 1-2 天。这将有助于恢复他们的自然水合作用水平。在小鼠低于其记录的基线体重的 90% 的情况下，应将其过渡到 随意 饮水，直到达到基线体重的 90%。低于其记录基线体重的 80% 的小鼠应进行道德安乐死。
8. 在行为评估后至少 30 分钟延迟给予他们的每日饮水剂量，以减少对准确进行实验至关重要的自然口渴行为的潜在干扰。
   注意：在试用后立即提供液体奖励可能会无意中影响小鼠的表现，因为它们可能会预期会立即获得奖励，从而可能影响任务参与度。因此，试验后延迟取水可以防止习惯于立即提供奖励，并保持实验设置的完整性。

3. 系统设置

1. 熟悉设备：有关 VR 行为系统的硬件组件和其他注意事项，请参阅以下步骤。
   有关协议对类似系统设置的普遍性的检查，请参阅讨论部分。
   1. 完全身临其境的虚拟显示器或圆顶：这种虚拟显示器在可定制的虚拟环境中为动物提供完全沉浸感。虚拟环境中的运动与球形跑步机上的运动同步。
   2. 液体奖励系统：液体奖励系统通过使用蠕动泵输送液体增强剂（水或糖水）来发挥作用，当任务成功执行时，蠕动泵通过延伸到鼠标的塑料涂层金属管引导奖励解决方案。它包含监控鼠标在试用期间获得的奖励数量的传感器。
      1. 每周使用乙醇或其他清洁剂清洁奖励管。为此，通过管子冲洗 2-5 mL 清洁剂，类似于液体奖励的输送，然后用等体积的水进行类似的冲洗。
      2. 开始实验时，通过在指定持续时间内激活奖励管并测量分配液体的体积来确定奖励管中液体奖励的分配率。该程序允许确定蠕动泵的液体输送速率。在本研究中，使用大约 0.0083 mL/s 的分配速率。
         注意：大多数系统为行为执行和奖励释放之间的持续时间提供可编程设置，从而能够根据每次试验的预期奖励量精确规划研究方案。使用的数量被确定为足够，因为它让老鼠有足够的时间消耗奖励，并且它的数量似乎是有激励性的。
      3. 某些协议可能需要鼠标舔奖励喷口才能启动奖励交付。对于此处使用的任务类型，没有采用此功能，仅根据成功执行所需行为（即在 y 迷宫中选择正确的手臂）来提供奖励。这有助于避免在训练早期失败，因为舔舐的倾向尚未充分建立，并且初始舔不太可能发生。它还允许测量奖励预期，这在某些情况下与导航表现无关¹¹。
      4. 虽然一些使用液体限制的实验选择通过奖励管使用标准水，但这里使用糖水（10% 蔗糖 v/v）作为作范式中的附加激励刺激。值得注意的是，在引入糖水后，观察到多个实验队列的性能得到增强。
   3. 聚苯乙烯泡沫塑料球：这个球充当球形跑步机。当有来自下方的空气缓冲时，训练老鼠在球上舒适地奔跑或行走。将其放在配备运动跟踪传感器的持球器上，该传感器可收集有关距离和速度的数据。
   4. 头架：将设备放置在鼠标后方，确保在将头杆连接到支架时与 VR 显示器视觉对齐。该装置对于将鼠标保持在头部固定位置至关重要，从而减轻运动伪影，尤其是当该系统与光学成像或电生理技术一起使用时。
   5. 气流硬件：配置从压缩空气源到球的气流，以创造一个有利于鼠标在球上奔跑的失重环境。这种设置需要一个流量调节器，以确保精确控制施加到球上的气压。球在失重环境中高效运行，空气供应最少。因此，在系统设置过程中，请确定必要的最小空气量，以促进球在支架内平稳、无阻碍地移动。建议流量在 10-20 L/min 之间。
2. 软件设置：有关系统运行的具体详细信息，请参见下文。
   注意：与视频游戏²¹ 的设计非常相似，虚拟世界的架构集成了关键元素，例如外部控制器、可编程导航环境和包含描述动态功能的状态图的时间表文件。这些组件协同融合，为从事研究的受试者打造有凝聚力的互动体验。该软件的运行效率取决于指定文件夹中的精确文件组织。此说明将概述填充预制模板所需的主要步骤，以便轻松调整现有文件并将其保存为新版本。这些新版本将构成研究的基础。
   1. 将以下三个文件一起使用来配置可作的虚拟环境。
      1. XML 文件：此文件格式使用户能够处理各种元素（如天空、地板和墙壁）的照片纹理。将用于图像的文件放在 VR 文件夹的 Data 子文件夹中。使用这些选项，指定迷宫的尺寸并确定鼠标在迷宫中的初始位置。使用这些文件在迷宫中的某些节点定义 3D 对象（视觉提示）。使用文本编辑器修改这些文件。
      2. XLSX 文件：这些文件用作命令文件，将所有三种文件类型（XML、XLSX 和 XAML）一起配置，以形成一个有凝聚力的交互式虚拟演示。使用这些文件定义运行 VR 及其附件的实验例程，例如增益灵敏度、提取哪些数据以及将哪些文件组合在一起以进行实验。
      3. XAML 文件：该软件应用程序提供了一个图形界面，用于通过使用流程图创建实验计划。它有助于定义试验的时间参数、试验完成后的传送控制以及试验框架内数字输出的激活时间。
   2. 使用以下应用程序在系统运行时采集数据和用户控制系统。
      1. [应用]VR：与显示代表性景观的 .XML 文件关联，打开该文件以在静态模式下预览显示器上的虚拟景观。对于动态交互，请打开配对配置。XLSX 文件。
      2. [应用程序] 控件：与 .XSLX 文件关联，打开此应用程序以查看与系统关联的附件设备。您可以手动伸出和缩回奖励管，分配液体奖励，并从这里查看实时数据采集。
      3. [应用程序] 计划设计器：此应用程序提供调整 XAML 文件的功能，以建立在实验中触发事件的计划。例如，设计一个可自定义的触发器来确定分配奖励的持续时间，并定义小鼠试验之间的休息持续时间。
3. 启动示例：首先根据步骤 3.2.1.1-3.2.1.3 中的可调组件决定研究方案的外观。明确定义作协议后，按照以下步骤打开 VR 系统预设的模板实验之一。
   1. 打开 VR 应用程序，该应用程序将打开 Data 子文件夹。将创建的虚拟景观另存为 XML 文件。打开此文件，虚拟景观应显示在 VR 监视器上。
   2. 打开 Control 应用程序并导航到屏幕右上角的 Open folder 图标。单击 Icon，这应该会显示 Configs 文件夹，其中相应的 .找到 XLSX 实验配置。打开 .XLSX 文件，该文件的名称与在 VR 应用程序中打开的 .XML 文件相同。定义的系统附件，如可扩展奖励装置的泵和电机，现在可以在应用程序的控制选项卡下看到。
   3. 启动实验试验，因为这两个应用程序之间的协调可以创建交互式虚拟景观。最终，这种集成有助于监控基本数据，包括 XY 平面中的距离和带有时间戳的奖励收集。
4. 数据采集：从系统中提取最有价值的行为数据，即带时间戳的位置数据和奖励。这些数据单独保存为日志文件。
   1. 位置数据：要获取此数据，请按照以下步骤作。
      1. 要获取小鼠的带时间戳的 XY 位置数据，首先打开所需数据采集迷宫的电子表格文件。在表 1 中，将命令 WriteVRAndCamInfoToFile 放在 A 列中其他单元格下方的一个单元格中。现在，试用后，位置数据将自动保存为注明日期的 CSV 文件（名为 Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv）到 configs 文件夹中。
      2. 要在试用后导出位置数据，请关闭控制应用程序，数据将保存为注明日期的 CSV 文件。此文件将包含特定日期的所有特定数据，因此请小心手动记录每个受试者的上球和下球时间。打开文件并使用 Unicode UTF-8 字符集导入它。A 列标记为 DateTime，右键单击 A 选项卡 ，然后单击 单元格格式.转到时间并单击 MM/DD/YYYY HH：MM：SS 选项。现在，每个系统事件都将按时间顺序编目，以便进一步进行数据分析。
   2. 奖励数据：要获取此数据，请按照以下步骤作。
      1. 泵激活（奖励分配）的数据会自动作为过时的日志文件保存在系统中，因此无需像输入位置数据那样输入命令。要访问这些内容，请转到 configs 文件夹的 Log Files 子文件夹。
      2. 对奖励数据的 Position data 重复步骤 3.4.1 以将数据导出为电子表格文件。打开配置文件夹，并在文件夹中查看时选择注明日期的奖励文件（名为 Corridor- MM.DD.YYY 或 Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY）。这将提供小鼠获得奖励的日期和时间，并且可以根据它们采用的范式将其用于进一步的数据分析。

4. 行为任务

注意：根据行为神经科学的既定方法，制定的任务采用了基于奖励的联想学习技术。通过使用即时奖励来强化特定行为，动物在 VR 的传送功能的帮助下得到有效的训练来执行重复性任务。在虚拟行为框架中，传送功能使老鼠能够在没有与物理作相关的压力的情况下参与任务，同时减少类似现实世界任务所需的设置持续时间。在训练期间，在实验环境中使用暗红色的头顶照明。建议采取这种预防措施，因为小鼠对红光的视觉感知敏感性降低，与使用白光相反，这减轻了对它们对虚拟现实 （VR） 屏幕感知的潜在干扰²²。

1. 习惯
   1. 在他们习惯于液体调节的同时，开始对球形跑步机的适应，以使用正确定时的生理动机将舔管与奖励联系起来。建议在开始线性田径训练之前进行为期三天的适应期。
   2. 第^{1 天，} 称重后处理小鼠 5 分钟。在这种互动过程中，建议当小鼠在笼子里时轻轻抓住头杆植入物，从而熟悉这种作。向他们介绍这一天 VR 所在的区域，以便他们预测将进行实验试验的空间环境。习惯的第一天恰逢开始每 100 mg 体重 15 mL 的液体调节。
   3. 在^第 2 天，与过渡到每 100 mg 体重液体调节步骤 10 mL 一致，再次处理小鼠 5 分钟。在笼子里继续反复轻轻地抓住头杆。将头杆固定在支架上，同时让小鼠在无限重复的轨道上或不激活软件程序的情况下熟悉球形跑步机 5-20 分钟。这有助于它们适应头部固定的条件。应该预料到小鼠在此期间可能会排泄废物，这通常会在连续的会话中减少。
   4. 在^第 3 天，对应于液体调节范式的最后一天（每 100 毫克体重 5 mL），处理小鼠 5 分钟。然后，将他们牢固地连接到气垫球形跑步机上，并通过奖励管向他们介绍液体奖励。
      1. 将舔嘴介绍给天真的老鼠一开始会让它们感到困惑，因此请确保老鼠知道它们应该从管子里喝水。
   5. 不要太用力，应用下面的鼠标定位指南，并以舒适的方式将鼠标在球上相对于管子的位置个性化，从而向他们提供奖励。开始时，确保小鼠从管子中喝水;当给小鼠喝液体时，在水受限的条件下自然地会发生这种情况。
2. 放置鼠标
   1. 预定位：在将鼠标放在球上之前，在尖端用一小滴奖励来延长居中的奖励管。在将鼠标放在球上之前，请延长奖励管，以防止在鼠标头部固定后因无意中将奖励管向前伸得太远而造成任何潜在的伤害。将奖励管抬高到球形跑步机上方 5-15 毫米处，这样舔喷嘴需要头部自然地向前移动。
   2. 头部固定：要对鼠标进行头部固定，请将鼠标放在球形跑步机的纵者惯用侧。然后，使用处理程序的惯用手，通过鼠标的头杆将鼠标拉向头部固定平台。将头杆放入用于固定的槽中，然后用处理者的非惯用手将头杆卡入到位。
   3. 球上的位置：为每只鼠标在球形跑步机上个性化放置，但要确保它们满足以下要求，以确保品尝奖励的动力并最大限度地减少整体压力水平。
      1. 将鼠标的中矢状平面与球形跑步机的中心对齐。在头杆不直的情况下，确保鼠标的中矢状面（而不是头杆）与放置中心对齐。为了直观起见，请参见 图 3C。
      2. 确保鼠标的后爪距离球形跑步机的顶点不超过 11 厘米，并且头部在顶点后面。确保所有四只爪子都接触跑步机，并且当鼠标静止时腹部可以接触跑步机;这将支持正确的步态和在球上的稳定性以进行跑步。
      3. 当老鼠不跑时，这称为排球。如果小鼠继续冻结并且不尝试奔跑，它们可能会经历过度焦虑，并且正如研究者选择将它们排除在实验之外。在这项研究中，使用拒绝球 5 天的定量阈值来确定从数据中排除。
   4. 侧面偏差：当小鼠第一次开始习惯训练程序时，它们会偏爱一侧而不是另一侧。这可能会干扰任务的执行，因此请注意确保任何侧面偏好不是由于动物在球上的安装方式不对称造成的。这里采用的 y 迷宫任务特别要求动物做出左右选择，以优化奖励传递，这有助于克服侧面偏好。
   5. 奖励喷口：这种方法涉及一种称为 kiss it 方法的温和动作，其中鼠标被引导到延长的舔管，直到它的嘴几乎接触到喷口的尖端，从而确保奖励的准确传递。当小鼠获得奖励时，将延长奖励管的持续时间设置为 1 秒，让小鼠有足够的时间充分消耗液滴。为每只鼠标个性化舔嘴位置，因为每只鼠标的大小和首选位置可能不同。确保奖励管在所有试验中保持居中，以实现舔舐标准化;无论虚拟迷宫设计如何，鼠标都应该始终期望在同一物理位置收到奖励。
      注意：虽然该持续时间的确定由研究者自行决定，但这些发现表明，该时间范围可有效促进小鼠在管缩回之前完全摄入奖励。 图 3B 显示了一个首选放置位置的示例。
   6. 线性跟踪：与之前采用类似方法的研究一致，使用线性跟踪任务来调查两个关键查询：训练小鼠穿越笔直走廊所需的时间和小鼠获得奖励的预期成功率。
      1. 确保小鼠已经适应了液体限制范式和实验硬件。
      2. 每天进行一次 30 分钟的课程，以 1 m 的长度开始沿着线性虚拟走廊移动。到达走廊尽头并获得糖滴奖励后，将老鼠传送回起点。
      3. 确定基于标准的进度到更长的迷宫（例如，1 m、2 m、3 m）。在连续 2 天平均每分钟获得 2 个奖励后，将小鼠推进到下一个迷宫长度（图 4A）。
      4. 记录有关奖励检索的时间戳数据的每日记录，以及小鼠在球形跑步机上行驶的距离以供进一步分析（图 4B-D）。
      5. 对于在 3 m 线性轨道上平均每分钟获得 2 个奖励的小鼠，将它们标记为精通线性轨道范式。建议小鼠在进行需要决策的更复杂的行为任务之前达到此阶段。
   7. 需要决策的复杂行为任务（Y 迷宫）：此阶段探讨从需要决策的简单行为任务发展到更复杂的行为任务的可行性。为此，请创建一个设计的信号鉴别 Y 迷宫任务。
      1. 在这个 Y 迷宫范式^23,24 中，确保鼠标导航到一个选择点，其中两条手臂像 Y 形一样向任一方向伸出 45°。停用从迷宫起点到到达选择点的旋转，两条不同颜色的手臂，然后在决策区域内激活它，让鼠标转向所需的方向。
      2. 进入通往奖励区域的手臂后，再次停用旋转。黑色臂表示正确的路径，而白色臂表示不正确的路径。使用黑臂和白臂作为提示，以适应小鼠视力的潜在限制，因为它们很容易区分，有助于以最简单的形式检查它们对视觉信息的使用情况。
      3. 训练老鼠向黑色手臂导航以获得糖奖励，每次试验结束时，老鼠都会被传送回起始位置。在实验设计中加入左侧和右侧之间奖励位置的随机洗牌，确保小鼠将奖励与视觉线索而不是特定侧相关联。
      4. 使用与线性走廊相同的步骤 Y 迷宫。将 Y 迷宫范式的进展标准与线性走廊的标准镜像：每次试验持续 30 分钟，小鼠需要连续 2 天达到预定的奖励阈值。根据 Y 迷宫中先前试点队列的平均表现，建议正确获得 70% 奖励的阈值;它高于机会阈值 （50%），它代表了一个合理达到的百分比，表明小鼠理解了该任务（图 5A）。
      5. 到达选择点后，确保鼠标选择正确或不正确的臂之一。在手臂的末端，将其传送回起点，在 30 分钟的时间范围内重复迷宫。
      6. 这种方法采用了受视觉心理物理学启发的方法，其中迷宫变得越来越难以区分。请按照下面的描述了解 Y 迷宫范式中的进度。
         1. 在最初的 Y 迷宫中，在迷宫的选择点显示黑色和白色实线臂。如果鼠标连续 2 天在 70% 的试验中正确选择了黑色手臂，则将其推进到下一个级别，执行越来越具有挑战性的鉴别任务。为此，在每个进度级别逐渐向每个手臂引入额外 10% 的对比色。例如，将白色臂过渡到由 90% 的白色和 10% 的黑色组成，反之亦然，这使得每次进步的区分要求都更高。
            注意：增加的想法是，如果可以达到 50% 的白色/黑色，这将是一个有效的控制，因为手臂将无法区分。然而，小鼠能够在视觉上区分的最远距离是 80%：20%（图 5B）。

结果

这项试点研究旨在概述在两个不同任务中有效训练小鼠的方法：简单的走廊和复杂的决策任务（Y 迷宫视觉识别任务）。这些数据是建立 VR 行为训练时间指南的基础。

程序步骤首先概述了 图 1 中头杆的手术植入。这种植入物用于在行为评估期间稳定小鼠的颅骨，从而提高神经记录的精度，尤其是在与电生理学或成像技术结合使用时。

图 2 和图 3 说明了实验系统的硬件组件和设置。图 2 详细说明了使用培养皿喷泉方法的输水系统。这包括将 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝下固定在笼子地板上，将较小的 35 mm x 10 mm 培养皿凹面固定在较大培养皿的中心，并将另一个 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝上放置在较小培养皿的顶部，作为储水器。仔细调整上盘的高度，以防止被垫料污染，同时确保小鼠易于取水。

图 3 显示了系统硬件和鼠标定位指南。 图 3A 描绘了 VR 设置，该设置具有一个六屏幕阵列，球形跑步机位于中央。 图 3B 显示了鼠标在跑步机上的最佳位置，头部处于自然位置，所有四个爪子都与表面接触。 图 3C 比较了鼠标相对于头杆的正确和错误位置，强调鼠标的中矢状面应居中，而不是与头杆本身对齐。

图 4 以折线图的形式显示了奖励获取曲线，说明了 VR 中 1 m、2 m 和 3 m 狭窄走廊的预期学习期，这些时间基于预定义的进展参数。它描述了小鼠在相应轨道长度上的平均速度，表明速度逐渐增加，这是与难度增加相称的任务学习和改进的证据。还显示了一个条形图，说明了小鼠达到线性轨迹标准所需的平均天数，以及一个显示每个轨迹长度的平均速度的条形图。在此之后，还说明了小鼠学习的线性跟踪任务的渐进阶段。这些任务旨在复制学术文献中建立的方法，同时确保小鼠的学习曲线可行，促进它们通过各个级别取得进步。

最后， 图 5 提供了与 Y-Maze 任务相关的数据。该图说明了任务的渐进性质，首先是直接区分实心黑色和白色手臂。这个初始阶段作为基础步骤，建立小鼠区分对比视觉线索的能力。任务的后续级别通过向每个手臂添加额外百分比的对比色来引入越来越复杂，从而进一步挑战小鼠的辨别能力。任务难度的逐渐增加表现为从纯黑色和白色手臂过渡到由一种颜色的 90% 和另一种颜色的 10% 组成的手臂。值得注意的是， 图 5 中提供的数据表明，虽然区分准确性随着每个级别的进展而提高，但一些小鼠始终表现出视觉辨别能力的阈值，最高达到 80%/20% 的白人/黑人辨别能力。这一观察强调了小鼠在 Y-Maze 任务背景下视觉辨别能力固有的局限性，为任务的可行性和受试者的认知能力提供了有价值的见解。随后，详细介绍了 Y 迷宫跟踪任务的渐进阶段，这些阶段旨在与文献中的既定方法保持一致。这些阶段确保了小鼠的可行学习曲线，支持它们逐步通过各个级别。

图 1：头杆植入手术说明。 （A） 切口部位标记在小鼠的颅骨上。（B） 螺钉应植入前囟略下方额间缝线左侧 1 毫米处，额间缝线右侧略高于 lambda 上方 3 毫米处。（C） 头杆应沿额间缝合线放置。（D） 在头杆植入物上涂抹牙科粘接剂。（E） 应用牙科粘固剂后头杆的实际可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：使用培养皿喷泉方法的输水系统。 将 60 mm x 15 mm 培养皿凹面朝下固定在笼地板上。一个较小的 35 mm x 10 mm 培养皿位于较大的培养皿的中心，另一个 60 mm x 15 mm 培养皿将凹面朝上放置在顶部作为储液器。这种设置确保了水不受床上用品的污染，并且可供老鼠使用。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：鼠标指南的系统硬件和定位。 （A） 这将显示所使用的 VR 设置。使用了六屏设置，球形跑步机位于中间。（B） 球形跑步机上鼠标最佳放置的侧视图。鼠标头处于自然位置，而所有四只爪子都在球形跑步机上。（C） 鼠标相对于头杆的正确和错误放置的俯视图。为了正确放置，鼠标的中矢状面应居中，而不是头杆本身。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：线性轨迹数据。 （A） 提供的数据描述了每 30 分钟试用期内收集的每日奖励。一旦小鼠在连续 2 天内平均每分钟达到 2 个奖励，总共 60 个奖励（阈值），它们就会发展到更长的轨迹长度。（B） 随着小鼠熟练掌握任务，它们的速度逐渐增加，表明奖励强化的有效性。该图说明了轨道上每只鼠标的平均每日速度（以 cm/s 为单位），描绘了学习行为的线性进展。（C） 此条形图说明了每只鼠标熟练掌握单个轨迹长度所花费的持续时间，并描述了每个轨迹长度的相应平均值和标准误差。（D） 该条形图显示了每只小鼠在不同轨迹长度上达到的平均日速度的平均值和标准误差。近乎线性的进展表明跑步速度的习得性增强。（E） 这说明了线性跟踪任务的进展，该任务需要连续 2 天的 60 个奖励的试用日，然后才能升级到更长的迷宫版本。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：Y 迷宫数据。 （A） 这显示了在 Y 迷宫进程的不同阶段获得的奖励分布。该分析仅关注完成线性轨道所有阶段的四只小鼠的子集，从而确保男性和女性参与者的公平代表。（B） 这种视觉表示说明了 Y-Maze 任务的各个阶段，其中小鼠在连续两天获得 70% 正确选择后前进。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

本研究采用综合方法来调查小鼠在 VR 环境中的行为反应，重点是外科手术的实施、液体限制方案、系统设置和行为任务。这些发现通过提供程序细节、训练时间框架和成功率为该领域做出贡献。这将使 VR 程序在小鼠中更有效地采用，并促进有兴趣在研究中使用该程序的实验室的规划和实施。

头杆的手术植入对于促进 VR 环境中的头部固定行为实验至关重要。通过仔细遵循既定方案并提供适当的术后护理，确保了头杆的成功整合，同时最大限度地减少了对动物健康和行为的不利影响。此外，实施了液体限制方案以调节饮水量并维持小鼠的水合作用和口渴水平。逐渐适应过程和定期取水对于确保动物的福利同时促进行为任务的执行至关重要。

VR 行为系统的设置涉及硬件和软件组件的集成，以便为小鼠创建身临其境的虚拟环境。利用完全沉浸式的虚拟显示器、液体奖励系统、聚苯乙烯泡沫塑料球作为球形跑步机和头架，可以精确控制实验条件和数据采集。行为任务，包括线性跟踪和 Y 迷宫范式，经过精心设计，以研究小鼠行为的关键方面，例如运动、决策和奖励处理。

尽管尽了最大努力优化实验程序，但在研究过程中遇到了一些挑战。单个小鼠反应的可变性以及与硬件和软件集成相关的技术问题对数据收集和分析提出了挑战。此外，对液体限制方案的依赖需要仔细监测动物的水合状态并相应地调整实验程序。有时，老鼠在被放在球上时会挣扎，不能从奖励喷口喝水，或者冻结并且无法在球上奔跑。尽管其中一些挑战可能是暂时的，但监测小鼠以确保它们在前进过程中没有遇到障碍至关重要。与同龄人相比未能表现出进步的小鼠应退出研究。一项类似的实验将 55 只小鼠中的 4 只由于无法学习范式²⁵ 而被移除。在对小鼠的体重、进入奖励嘴饮水的能力以及在球上的位置以确保不存在潜在问题后，连续 5 天在球上表现出持续不动的小鼠被排除在研究之外。在这些情况下，由研究人员自行决定采取何种策略来有效恢复研究。

这些训练方案旨在逐步挑战小鼠，同时确保它们熟练执行行为任务。从线性轨道进展到 Y 迷宫范式的标准基于小鼠满足预定性能阈值的能力，例如实现连续几天的成功试验和获得奖励。严格的训练方案的实施使我们能够评估小鼠的行为能力和对日益复杂任务的适应性。这些精心构建的协议为行为神经科学领域的研究人员提供了一个强大的框架，提供了一种系统的方法来评估和训练动物以适应不同的实验范式。通过概述明确的进步标准，研究人员可以有效地衡量实验对象的学习曲线并相应地策划训练范式。此外，这种方法促进了实验的可重复性和标准化，促进了比较分析并促进了对动物模型中认知过程和学习机制的理解。

在为小鼠设计 VR 范式时，认识到有关任务复杂性和训练进度的可用方法范围至关重要。该协议为构建实验设计提供了广泛的框架，但仍然由研究者根据研究的需要定制特定方面，例如奖励交付、偏差控制、刺激类型、任务进展和系统参数。 例如，一些研究选择了一种更简化的方法，专注于即时任务参与。一个例子是 Krumin 等人，他们实现了一个单一的、一致的 T 迷宫任务，而不是在不同任务之间采用渐进式学习方案。相比之下，其他研究提供了不同的试验设计组成部分，例如刺激强化策略和听觉线索。该研究利用听觉反馈作为对错误试验的惩罚，并且只提供水作为对正确试验的奖励²⁶。相反，Zhao 等人使用 10% 蔗糖溶液作为对正确试验的奖励，并且没有对错误试验进行任何形式的惩罚²⁷。相反，他们专注于通过反偏见训练等方法减少错误反应，其中包括增加从动物先前的选择改变提示方向的可能性，并调整每日饮水量以提高动机。实验设计的差异，例如整个任务中存在空间线索，可能导致对神经编码的不同解释，Zhao 等人发现后顶叶皮层细胞选择性由轨迹和空间偏好解释，这与 Harvey 等人观察到的选择依赖性激活序列形成鲜明对比^27,28.需要注意的是，使用的特定硬件包括六个 LCD 显示器、一个可伸缩的舔嘴和一个气垫泡沫塑料球形跑步机。不同实验室的虚拟现实系统存在许多差异，包括投影仪²⁹ 与计算机显示器的使用、非球形跑步机³⁰ 的使用以及固定¹⁰ 与可伸缩的舔嘴的使用。

总之，这项研究为小鼠在 VR 环境中的行为反应提供了有价值的见解，并证明了采用沉浸式技术研究复杂行为的可行性。未来的研究工作可能侧重于完善实验方案、探索决策过程背后的神经机制以及将研究结果转化为临床应用。通过继续推进对小鼠行为的理解，科学家可以进一步阐明健康和疾病中复杂行为背后的神经回路和认知过程。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube