通过脾内注射腺相关病毒血清型 8 （AAV8） 递送的小发夹 RNA 在肝脏中高效敲低基因

摘要

该方案描述了脾内注射 AAV8 递送的小发夹 RNA 如何在肝脏中实现与门静脉注射相同的基因敲低效率，代表了一种更简单的手术，围手术期和术后死亡率和并发症要低得多。

摘要

肝脏是执行基本代谢功能的主要器官。开发一种有效且安全的敲低肝脏基因表达的方法为确定肝脏病理生理学中的基因功能提供了重要工具。在这项研究中，我们描述了一种脾内注射腺相关病毒血清型 8 （AAV8） 的方法，该方法被改造成表达针对目标靶基因核干蛋白 （NS） 的小发夹 RNA （shRNA）。与注射表达加扰序列 shRNA （AAV8-shScr） 的 AAV8 相比，脾内注射表达 NS 靶向 shRNA （AAV8-shNS1） 的 AAV8 在肝脏中实现了与 NS 相同的敲低效率。此外，注射 AAV8-shRNA 病毒在肝实质中引发了最小的炎症反应。最重要的是，这种脾内注射方案在技术上要求不高，并且在注射部位引起的出血量很小，这是进行门静脉注射时围手术期和术后死亡的主要原因。这项研究报告了一种改进且相对安全的方法，可以在肝脏中实现有效的基因敲低。

引言

肝脏是代谢营养物质和化学物质的重要器官，但也经常暴露在细胞毒性和致癌性损伤中。虽然成人肝脏在受伤后能够再生，但其再生能力在¹ 岁时受到严重阻碍。迄今为止，终末期慢性肝病或大面积急性肝损伤患者的唯一治疗选择是肝移植，这本身就带来了许多挑战²。为了通过询问目标基因的功能来更好地了解肝脏的分子病理生理学，已经开发了用于 体内 应用的基因作，包括 RNAi 介导的敲低和在 loxP 位点存在下通过 Cre 重组酶进行靶向缺失³。Cre 表达盒和 shRNA 构建体可以通过病毒载体递送。

腺相关病毒血清型 8 （AAV8） 是一种稳健的载体，可将基因递送至选择性组织类型（例如肝脏、骨骼肌、心脏、大脑和胰腺），效率高，炎症反应低 ^4,5。为了靶向身体内部器官，AAV8 通常通过尾静脉注射引入，其中病毒颗粒首先穿过肺部，然后到达体循环。相比之下，门静脉注射使它们能够先到达肝脏，然后再通过肺部循环，这是隔离和稀释的潜在来源。然而，门静脉注射在技术上具有挑战性，并且经常因手术引起的出血和高死亡率而复杂化。为了在肝脏中实现有效的基因敲低 （KD），同时避免围手术期/术后高死亡率的问题，我们测试了一种脾内注射携带靶向核干细胞蛋白 （NS） 的工程 shRNA 的 AAV8 （AAV8-shNS1） 的方法，并将其 KD 效率与门静脉注射的 AAV8-shNS1 进行了比较。

NS 是一种富含干细胞/祖细胞的蛋白，首先在神经干细胞中发现，后来在其他类型的干细胞和癌症中发现 ^6,7。NS 的生物学重要性表现在种系 NS 敲除 （NSKO） 小鼠体内的早期胚胎致死表型 ^3,8 和 NSKD 诱导的体外自我更新的扰动 ^9,10。在成年动物中，在睾丸和一些正在再生的组织中发现高水平的 NS 表达，包括静脉切除术后去分化的蝾螈色素上皮细胞和截肢后的肌肉细胞¹¹，以及再生的哺乳动物组织，例如心脏损伤后的小鼠心肌细胞¹² 和肝损伤后的肝细胞（例如，CCl₄）或手术切除（例如， 部分肝切除术）^13,14。此外，NS 已被证明在乳腺、肝脏和口腔肿瘤的发展中起重要作用 15,16,17。从机制上讲，NS 已被证明可以通过保护复制基因组免受 DNA 损伤来促进自我更新^18,19。然而，由于种系 NSKO 的早期胚胎致死表型，需要一种在组织发育完成后暂时引入 NSKD 的实验方法，以进一步确定其在成体器官中的生物活性。

在本文中，我们以 NS 为例来说明一种有效且程序诱导死亡率低的 体内 肝脏基因 KD 方法的建立和测试。

研究方案

本研究中完成的所有动物实验均由休斯顿德克萨斯 A&M 大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会 （IACUC）（批准号：2021-0264-IBT）审查和批准，并按照所有相关法规和机构指南进行。使用雌性 C57BL/6J 小鼠 （4-5 个月大，体重 23-30 g）。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. AAV8-shRNA 设计和生产

注意：有关程序详情，请参阅 Sands et ^al.4 。

1. 设计靶向目标基因编码区内 21 个核苷酸长序列的正义和反义 shRNA 寡核苷酸。在这种情况下，使用小鼠 NS （shNS1） 和 21 个核苷酸的加扰序列作为阴性对照 （shScr）（图 1A，下图）。
2. 在发夹结构中包括 TTCAAGAGA 的茎环序列、5' 平末端、3' XhoI 兼容的粘性末端以及 5'-GAA CTA、AAA、CAG、CAG、CAG、AAA-3' （shNS1） 的基因特异性靶向正义序列或 5'-TCT CGC、TTG、GGC、GAG、AGT AAG-3' （shScr）。
3. 磷酸化和退火每对寡核苷酸。
4. 消化 AAV 基因转移载体、AV5-siRNA-GFP（图 1A，上图）与 HpaI 和 XhoI，去磷酸化，并凝胶纯化载体片段。
5. 将退火的寡核苷酸连接到凝胶纯化的载体中。
6. 将连接的 DNA 产物转化为具有亚克隆效率的感受态 DH5α 细菌。
7. 通过氨苄青霉素抗性挑选单个克隆，并培养 100 mL 细菌培养物用于质粒小量制备。通过测序确认克隆正确，并使用市售的无内毒素试剂盒（遵循制造商的说明）制备质粒。
8. 使用 iMFectin 转染试剂将 AV5 转移载体、Rep/Cap 血清型 8 和 AdF6 辅助质粒转染到 293T 细胞中，从而包装 AAV8 病毒。共转染 40 × 15 cm 培养皿，并在转染后 3 天收获/消化。
9. 通过细胞裂解回收细胞相关 AAV8，并用 40% PEG 沉淀培养基分泌的 AAV8。消化后，将 AAV8 病毒混合在细胞裂解物和培养基中，在不连续的碘克沙醇梯度上纯化，并在分子量截留离心装置 （1,00,000 MW） 中浓缩。
10. 通过带有引物的绝对终点 qPCR 定量 AAV8 滴度：WPRE-172 （5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3'） 和 WPRE-392 （5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3'）。

2. 脾内注射 AAV8（图 1B、1C） 

1. 将 C57BL6/J 小鼠置于充满 2% 异氟醚和氧气的麻醉室中（遵循机构批准的方案）。意识丧失后，将小鼠以右侧卧位转移到无菌手术区域。用 2% 异氟醚维持麻醉，氧气通过鼻锥输送。
2. 用 2% 洗必泰和 80% 乙醇对切口部位进行消毒。用一把 6.3 英寸的医用剪刀在左上腹壁上切开 15 毫米，然后在腹膜上切开 10 毫米。
3. 用镊子轻轻露出脾脏，并用放在器官下方的湿纱布将其固定到位。
4. 使用 30 G 针头在 30 秒内轻轻混合并将 AAV8 病毒 （50 μL） 注射到脾脏中，尖端位于表面以下 3 毫米的深度（图 1B）。用一根棉签覆盖注射部位并按压 1 分钟。
5. 用 4-0 可吸收铬肠缝合线缝合腹膜。
6. 用 4-0 丝缝合线闭合腹壁和皮肤。
7. 将老鼠放在电热垫顶部的干净笼子中，并监测它们直到恢复。

3. 门静脉注射 AAV8

1. 通过吸入异氟醚 （2%） 与氧气混合（遵循机构批准的方案）麻醉 C57BL6/J 小鼠。
2. 通过皮肤上的中线切口（~1 英寸）进行剖腹手术 ^4,13，然后进入腹膜。
3. 将浸泡在无菌生理盐水中的无菌纱布垫放在鼠标左侧，用无菌棉签轻轻拉出大肠和小肠。将肠道放在湿纱布上，并用垫子盖住，以免接触皮肤或干燥。
4. 用 32 G 无菌针头将 AAV 病毒注射到门静脉中，体积为 50 μL。将针头以小于 5 度的角度插入端口静脉 3-5 毫米。让血液流过针头 5 秒以避免回流。
5. 将无菌棉签尖端放在注射部位顶部，轻轻按压，直到静脉完全闭合且无出血（约 5 分钟）以避免出血。
6. 轻轻地将内脏器官放回腹腔。
7. 用 4-0 丝缝合线闭合腹壁和皮肤。

4. qRT-PCR 分析

1. 按照制造商的说明，使用市售的 RNA 分离试剂从 50-100 mg 肝组织中提取 RNA ^4,13（参见材料表）。
2. 用随机六聚体和 M-MLV 逆转录酶从总 RNA 合成第 1^链 cDNA^20,21。
3. 根据先前发表的报道，使用单色实时 PCR 检测系统和超混合 SYBR green 试剂确定靶基因和内参基因之间的 ΔC（t） 值 ^22,23。
4. 测量来自四个生物学重复和三个技术重复 （n = 12） 的 ΔΔC（t） 值。所有反应的 T_m 设置为 60 °C。使用两个内参基因 Rps3 和 Rplp0 确认结果。
5. 设计引物序列如下：Ns，5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' 和 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3';Rps3， 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' 和 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3';Rplp0， 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' 和 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'。

结果

脾内注射肝脏中基因 KD 的效率 vs.门静脉注射 AAV8-shRNA
将 AAV8 病毒储液稀释至每毫升 2E+12 个基因组拷贝 （gc/mL） 的工作浓度。 通过 脾内或门静脉注射给个体小鼠注射 AAV8-shNS1 或 AAV8-shScr 的 1E+11 gc （50 μL）。注射后 2 周，收集肝组织用于 RNA 分离、1^st 链 cDNA 合成和 qPCR 分析。结果表明，使用 Rsp3 和 Rplp0 作为内部参考，脾...

讨论

通过在野生型背景^24,25 中病毒递送表达 shRNA 的构建体或在絮凝背景中表达 Cre 重组酶的构建体²⁶ 来传递基因 KD，这是一种以诱导型、时间控制的方式在体内询问基因功能的强大方法。体内基因 KO/KD 研究的理想递送方法应在感兴趣的器官中实现高 KO/KD 效率，此外，该程序本身在技术上应简单，围?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon filter centrifugation units	MilliporeSigma	UFC9100	Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP	Addgene	#124972	Plasmid
Competent DH5α bacteria	Invitrogen	#18265-017	Chemically competent strain for cloning
HpaI	New England Biolabs	R0105	Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent	GenDepot	I7100-101
M-MLV reverse transcriptase	Promega	M1708	RNA-dependent DNA polymerase
MyiQ single-color real-time PCR detection system	Bio-Rad	BUN9740RAD	qRT-PCR
Omega endotoxin-free kit	Bioteck	D6915-03	Plasmid DNA midi prep
Random hexamers	Invitrogen	48190-011
Supermix SYBR green reagent	Bio-Rad	1708882	Real-time PCR applications
T4 DNA Ligase	Promega	M1801
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596-018	Isolation of high-quality total RNA
XhoI	New England Biolabs	R0146	Restriction enzyme