通过细胞外囊泡释放 LC3-II 与细胞内 LC3 阳性囊泡积累的关系的评价

摘要

在这里，我们提出了通过免疫印迹简明评估细胞外囊泡 （EV） 中自噬体标志物 LC3-II 水平的方法。对 EV 中 LC3-II 水平、自噬溶酶体形成和奥米加小体形成的分析表明，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，STX6 在 LC3-II 阳性 EV 的释放中发挥新作用。

摘要

（宏）自噬代表了一种基本的细胞降解途径。在这个过程中，称为自噬体的双膜囊泡吞噬细胞质内容物，随后与溶酶体融合进行降解。除了经典作用外，自噬相关基因还调节涉及炎症分子、组织修复因子和细胞外囊泡 （EV） 释放的分泌途径。值得注意的是，细胞之间传播病理蛋白质的过程，特别是在影响大脑和脊髓的神经退行性疾病中，强调了了解这一现象的重要性。最近的研究表明，反式反应 DNA 结合蛋白 43 kDa （TDP-43） 是肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性的关键参与者，通过富含自噬体标志物微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3B-II （LC3-II） 的 EV 以自噬依赖性方式释放，尤其是当自噬体-溶酶体融合受到抑制时。

为了阐明 LC3-II 阳性 EV 形成和释放的潜在机制，必须建立一种可访问且可重复的方法来评估细胞内和细胞外 LC3-II 阳性囊泡。本研究提出了一种详细的方案，用于通过免疫印迹评估通过差速离心获得的细胞和 EV 组分中的 LC3-II 水平。巴弗洛霉素 A1 （Baf） 是自噬体-溶酶体融合的抑制剂，可作为阳性对照，以增强细胞内和细胞外 LC3-II 阳性囊泡的水平。肿瘤易感基因 101 （TSG101） 用作多泡体的标志物。应用该方案，证明 siRNA 介导的突触融合素 6 （STX6） 敲低是散发性克雅氏病的遗传危险因素，可增加用 Baf 处理的细胞 EV 部分中的 LC3-II 水平，同时对 TSG101 水平没有显着影响。这些发现表明，STX6 可能通过 EV 负向调节 LC3-II 的细胞外释放，尤其是在自噬体-溶酶体融合受损的情况下。结合评估自噬的既定方法，该方案为特定分子在 LC3-II 阳性 EV 的形成和释放中的作用提供了有价值的见解。

引言

反式激活反应 DNA 结合蛋白 43 （TDP-43） 是一种广泛表达的异质核糖核蛋白，参与调节外显子剪接、基因转录和 mRNA 稳定性，这些对细胞存活都至关重要 ^1,2。在肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和额颞叶变性 （FTLD） 等神经退行性疾病中，核蛋白 TDP-43 异常积聚在细胞质中。这种转变导致细胞核中 TDP-43 功能的丧失和细胞质中毒性的功能增加。TDP-43 的病理积累始于大脑和脊髓的特定区域，以朊病毒样方式传播到这些区域，这一过程与疾病进展密切相关³。然而，TDP-43 病理学通过大脑和脊髓传播的确切机制仍然未知。

TDP-43 通过细胞外囊泡 （EV） 分泌，在 ALS 和 FTLD-TDP 患者的血浆和脑脊液 （CSF） 中检测到 TDP-43 水平升高 ^4,5,6。诊断为 ALS 和 FTLD 的患者的 CSF 诱导人神经胶质瘤细胞中内源性 TDP-43 的细胞内错误定位和聚集⁷。因此，通过 EV 在细胞外释放的 TDP-43 可能介导 TDP-43 病理学的细胞间扩散。

自噬是一种保存完好的细胞降解机制，涉及将不需要的物质封闭在双膜囊泡内，称为自噬体，由 LC3 标记。这些自噬体与溶酶体相关膜蛋白 1 （LAMP1） 阳性溶酶体融合形成自噬溶酶体 （LC3⁺/LAMP1⁺），导致其内容物降解⁸。组织学分析表明，吞噬包涵体的自噬体在散发性 ALS 患者的神经元中积累⁹。家族性 ALS 和 FTLD-TDP 的一些致病基因与自噬的调节有关 10,11,12。这些发现表明 ALS 和 FTLD-TDP 患者的自噬受到抑制。

先前的研究表明，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，TDP-43 通过自噬体标志物 LC3-II 阳性的 EV 分泌¹³。自噬-溶酶体通路的失调不仅可能导致 TDP-43 的细胞内积累，还可能导致 TDP-43 通过 EV 的细胞外释放¹⁴。然而，目前尚不清楚 LC3-II 阳性 EV 是如何释放的，以及这对 TDP-43 病理学的传播有多重要。

EV 分为大型 EV（直径 100 至 1000 nm）和小型 EV（直径 50 至 150 nm），前者由细胞表面出芽产生，前者由内体膜向内体（称为外泌体）和高尔基体内部出芽产生。为了分别收集大型和小型 EV，我们分别以 20,000 × g 和 110,000 × g 的离心力进行顺序离心和收集颗粒。制备 P1 EV 馏分（20,000 × g 颗粒）以收集大 EV，制备 P2 EV 馏分（110,000 × g 颗粒）以收集小 EV¹⁵。通过免疫印迹顺序离心得出的评估大型和小型 EV 中 LC3-II 水平的方法稳定且可重复¹⁶。除了分析 EV 中的 LC3-II 水平外，分析自噬溶酶体和奥米加体的形成还有助于了解自噬失调如何导致 LC3-II 阳性 EV 的释放。在这里，本研究显示了突触融合蛋白 6 （STX6） 的抑制作用，这是一种 SNARE 蛋白，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，它促进运输囊泡向靶膜¹⁷ 的运动，在 LC3-II 阳性 EV 的释放中发挥作用。

研究方案

1. 从 HeLa 细胞的培养基中制备细胞、P1 和 P2 EV 组分

1. 从 HeLa 细胞的培养基中制备 P1 和 P2 EV 组分
   1. 第 1 天
      1. 使用细胞计数器计数细胞，并将 1 ×^{10 6} 个细胞接种在 6 cm 平板上，该平板含有由 DMEM 高葡萄糖、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素组成的培养基。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
   2. 第 2 天（可选）
      1. 制备 20 μM siRNA 溶液。
      2. 在低保留管中混合 100 μL 还原血清培养基和 3 μL siRNA，制备 溶液 A。
      3. 在低保留管中混合 100 μL 还原血清培养基和 5 μL 转染试剂，制备 溶液 B。
      4. 混合 溶液 A 和 溶液 B，然后在室温 （RT） 下孵育混合物 5 分钟。
      5. 将 溶液 A 和 B 的混合物添加到用于培养 HeLa 细胞的培养基中。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
   3. 第 3 天
      1. 用 PBS 洗涤细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 和受控湿度下将它们暴露于 500 μL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液中 5 分钟。
      2. 向细胞中加入 2.5 mL 培养基，并使用附有 200 μL 移液器吸头的巴斯德移液管制备单细胞悬液。
      3. 使用细胞计数器计数细胞，并将 1 × 10 6^{个细胞接种} 在 10 cm 平板上。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
         注:有必要准备至少 1 × 10⁶ 个细胞，以便从免疫印迹分析所需的培养基中收集 EV。
   4. 第 4 天
      1. 准备含有载体 （DMSO） 或 100 nM 巴弗洛霉素 A1 （Baf） 的培养基（参见步骤 1.1.1.1）。
      2. 将细胞暴露于含有载体或 100 nM Baf 的培养基中，并在 37 °C、5% CO₂ 和受控湿度下孵育 24 小时。
   5. 第 5 天
      1. 从 10 cm 板中收集所有培养基，将其转移到 15 mL 管中，并在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。
         注意:10 cm 板中的剩余细胞将用于第 1.2.1 节。
      2. 为了分离P1 EV级分，将上清液在3,000 × g 离心后转移到离心管中，然后在4°C下以20,000 × g 离心1小时。
      3. 为了分离 P2 EV 级分，将 20,000 × g 离心后的上清液转移到超速离心管中，然后在 4 °C 下以 110,000 × g 离心 1 小时。
      4. 用实验室抹布擦去管内多余的水分后，将离心管中剩余的沉淀重悬于 50 μL 2x 样品缓冲液 [2.5% SDS、125mM Tris-HCl 缓冲液 （pH 6.8）、30% 甘油、10% 2-巯基乙醇、0.4% 溴酚蓝] 中，以制备 P1 EV 馏分。
      5. 倾析去除上清液，用实验室抹布擦去管内多余的水分，然后将超速离心管中剩余的沉淀重悬于 50 μL 2x 样品缓冲液中，以制备 P2 EV 馏分。
      6. 将 P1 和 P2 EV 级分在 100 °C 下在加热块上孵育 10 分钟。
         注:以 20,000 × g 和 110,000 × g 离心后，请勿摇晃试管，以免意外丢弃剩余的沉淀。倾斜试管转移上清液后，保持试管的位置，以防止沉淀物再次浸入剩余的上清液中。
2. 从培养的 HeLa 细胞中制备细胞组分
   1. 第 5 天
      1. 将培养基从 10 cm 板转移到 15 mL 试管中后，用 PBS 洗涤 10 cm 培养皿中的细胞，并将它们暴露于 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液中，在 37 °C、5% CO₂ 和受控湿度下 5 分钟。
      2. 向细胞中加入 8 mL 生长培养基，然后使用带有 200 μL 移液器吸头的巴斯德移液管移液细胞并制备单细胞悬液。
      3. 将细胞悬液转移到 15 mL 管中，并在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟。
      4. 通过抽吸器除去上清液，向细胞沉淀中加入 PBS，然后在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。
      5. 使用抽吸器除去 PBS，并在 1 mL 含有 1% sarkosyl 的 A68 缓冲液 [10 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5,0.8 M NaCl，1 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N，N，N，N-四乙酸 （EGTA）] 中超声处理细胞沉淀。
      6. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测量细胞裂解物的蛋白浓度。
      7. 将 300 μL 细胞裂解物与 100 μL 4x 样品缓冲液混合，并在 100 °C 下将混合物在加热块上孵育 10 分钟以制备细胞组分。

2. 免疫印迹分析

1. 通过 SDS-PAGE¹⁸ 分离样品中等量的蛋白质。
2. 将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上。
3. 转移后，用封闭剂封闭膜 20 分钟。
4. 在室温下，将封闭的膜与指定的一抗在含有 10% （v/v） 小牛血清的 Tris 缓冲液中孵育过夜。
5. 用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后在 RT 下与生物素偶联的二抗孵育 2 小时。
6. 用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后将其与含有 0.4% （v/v） 溶液 A 和试剂盒中溶液 B 的 Tris 缓冲液在 RT 下孵育 1 小时。
7. 用 PBS 洗涤膜，然后将其与含有 0.04% （w/v） 二氨基联苯胺、0.8% （w/v） NiCl₂·6H₂O 和 0.3% （v/v） H₂O₂ 的 PBS 一起孵育，用于条带的比色检测。
   注:对于信号的检测，化学发光方法也是可以接受的。
8. 通过扫描仪将膜的图像数字化，并使用斐济对其进行密度分析。
   1. 使用 Fiji 打开数字化图像，然后单击 图像 |类型 |8 位。
   2. 单击 矩形工具 ，然后通过拖动矩形来调整矩形的大小以包围条带。通过单击 Analyze |凝胶 |选择 First lane（第一车道）。
   3. 将矩形放置在第二个和后续波段上，然后单击 Analyze |凝胶 |选择 Next Lane （下一车道）。
   4. 识别出最终条带后，单击 Analyze |凝胶 |Plot Lanes（绘制车道）。
   5. 用直线将频段的信号区域包围起来，单击 棒工具，然后在该区域内单击以计算该频段的信号强度。

3. 自噬体和自噬溶酶体数量分析

1. 第 1 天
   1. 使用细胞计数器计数 HeLa 细胞的数量，并在 3.5 cm 培养皿上接种 1 ×^{10 个 5 个} 表达 LAMP1-GFP 和 mCherry-LC3 的 HeLa 细胞。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
2. 第 2 天（可选）
   1. 在 3.5 cm 培养皿中执行第 1.1.2 节中描述的步骤。
3. 第 3 天
   1. 丢弃 3.5 cm 培养皿中的培养基。
   2. 用 PBS 洗涤细胞，将它们暴露于 400 μL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液中，并在 37 °C 下、5% CO₂ 和受控湿度下孵育 5 分钟。
   3. 向细胞中加入 1.6 mL 生长培养基，并用巴斯德移液管移液以制备单细胞悬液。
   4. 使用细胞计数器计数细胞数，并在 8 腔盖玻片上接种 1 × 10⁴ 个细胞。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
      注:如第 3.4.2 节所述，在 DMSO 或 Baf 处理后，分别为对照细胞和 STX6 敲低细胞制备腔室盖玻片的两个孔。
4. 第 4 天
   1. 制备不含酚红的生长培养基（不含酚红的 DMEM、10% FBS、1% 青霉素/链霉素），含有载体 （DMSO） 或溶于 DMSO 的 100 nM Baf。
   2. 用不含酚红的培养基替换培养基，含有载体或 100 nM Baf，并孵育 4 小时。
      注:为了评估 Baf 对自噬体和自噬溶酶体数量的影响，请准备载体处理的细胞作为对照。
   3. 观察前用 0.33 μg/mL Hoechst 33342 对细胞核染色 30 分钟。
   4. 在共聚焦激光显微镜上使用 60 倍物镜进行活细胞成像，并捕获 10 个不同的帧。
      1. 在斐济打开 RGB 合并图像，然后单击 Image |颜色 |Split Channels（拆分通道）。
      2. 通过单击图像 |Adjust |每个实验的阈值。
      3. 通过单击 分析 |分析粒子。选中 Summarize 框，然后单击 OK。记录 Count 中的值以识别自噬体和溶酶体相关的囊泡。
      4. 要将绿色图像叠加在红色图像上，请单击 编辑 |Paste Control （粘贴控件）。复制绿色图像，然后将其粘贴到红色图像上以合并它们，突出显示对红色和绿色信号均为正的区域。
      5. 要识别自溶酶体数量，请单击 Analyze |分析粒子。选中 Summarize 框，单击 OK，然后在 Count 部分中记录值，以识别与自噬体和溶酶体相关的囊泡。
   5. 将自噬溶酶体和自噬体的总数除以细胞总数，以计算每个细胞的自噬溶酶体和自噬体的数量。
      注意:在三个独立实验中，每个实验至少计数 35 个细胞。

4. 分析奥米茄小体的形成

1. 第 1 天
   1. 使用细胞计数器计数 HeLa 细胞的数量，并在 3.5 cm 培养皿上接种 1 × 10⁵ 个细胞。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
2. 第 2 天（可选）
   1. 执行第 1.1.2 节中描述的步骤。
3. 第 3 天
   1. 如步骤 3.3.1-3.3.2 中所述准备单细胞悬液。
   2. 使用细胞计数器计数细胞，并在 3.5 cm 培养皿上接种 1 × 10⁵ 个细胞。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
4. 第 4 天
   1. 在低保留管中混合 1 μg pEGFP-C1-hAtg13、3 μL DNA 转染试剂和 100 μL 还原血清培养基。将混合物孵育 20 分钟，然后将其添加到培养培养基中。
   2. 将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
5. 第 5 天
   1. 如步骤 3.3.1-3.3.2 中所述，用胰蛋白酶消化细胞。
   2. 向细胞中加入 2.5 mL 生长培养基。使用巴斯德转移移液管移液混合物以制备单细胞悬液。
   3. 使用细胞计数器计数细胞，并将 1 × 10⁴ 个细胞接种在 8 腔盖玻片上。将细胞在 37 °C 下，含 5% CO₂ 并控制湿度孵育 24 小时。
6. 第 6 天
   1. 按照步骤 3.4.1-3.4.4 使用共聚焦激光显微镜对步骤 4.5.3 中的细胞进行活细胞成像。捕获 10 个不同的图像帧。
      1. 按照步骤 3.4.4.1-3.4.4.3 将 RGB 合并图像拆分为相应的红色、绿色和蓝色图像分量，为每张图像中的绿色信号设置恒定阈值，并确定 GFP 信号强度。记录 Total Area 部分中的值以确定 GFP-ATG13 的信号强度。
      2. 将总信号强度除以检查的细胞数，以计算每个细胞的信号强度。
         注意:在三个独立实验中，每个实验至少计数 34 个细胞。

结果

如以前的研究所示，Baf 处理增加了 TSG101 （P1: P < 0.01， P2: P = 0.012，由 EZR¹⁹ 中的双向方差分析确定）和 LC3-II （P1: P < 0.01， P2: P < 0.01，由 EZR¹⁹ 中的双向方差分析确定）的水平在富含 EV 的部分中。值得注意的是，Baf 处理还增加了 EV 分数中 STX6 的水平 （P1: P < 0.01， P2: P < 0.01，由 EZR¹⁹ 中的双向方差分析确定） （

讨论

免疫印迹研究揭示了细胞组分中的 LC3-II 和 TSG101 水平、富含微泡的 P1 EV 组分和富含外泌体的 P2 EV 组分。活细胞成像用于检查自噬体、自噬溶酶体和奥米加体，深入了解 STX6 敲低是否影响自噬。这些综合结果表明， STX6 敲低会影响 LC3-II 阳性 EV 的释放，这可能与自噬途径的失调有关。这种方法的一个关键优势是它能够区分来自不同来源的大型和小型 EV。使用...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806