用于研究芸苔属植物耐缺氧性的卷心菜原生质体系统的开发

摘要

该协议描述了一种高效的卷心菜叶肉原生质体系统。测试了各种缺氧处理，该系统显示缺氧反应基因的高度激活，有助于研究 十字花科 蔬菜耐洪的遗传和分子机制。

摘要

随着气候变化带来更多的强降雨，卷心菜作为十字 花科 的主要蔬菜，由于洪水引起的缺氧胁迫而面临重大的产量损失。为了确定卷心菜耐洪的机制，需要一个多功能的遗传功能研究平台来克服卷心菜的转化顽固性。在本研究中，开发了卷心菜原生质体瞬时表达系统和相应的原生质体缺氧诱导方案。该方案实现了从卷心菜叶中分离原生质体的高产量和完整性，使用优化的酶条件，转染效率超过 40%。为了减轻治疗前潜在的缺氧影响，W5 溶液用氧气鼓泡以提高溶解氧水平。测试了几种用于调节氧水平和生理除氧处理的化学品，包括 EC-Oxyrase、OxyFluor、亚硫酸钠和脱氧剂包。双荧光素酶测定显示，缺氧处理后，甘蓝原生质体中厌氧呼吸反应基因 BoADH1 和 BoSUS1L 的启动子被激活，用脱氧剂包处理后观察到最高的诱导水平。综上所述，卷心菜原生质体瞬时表达系统结合缺氧处理展示了一种高效便捷的平台。该平台可以促进对卷心菜中缺氧反应相关的基因功能和分子机制的研究。

引言

全球气候变化加剧了洪水，而洪水已成为全球日益严重的问题。近几十年来，洪水事件的频率呈上升趋势，导致农作物遭受重大损失 ^1,2。卷心菜 （Brassica oleracea var. capitata L.） 是一种具有全球重要性的蔬菜，容易受到强降雨的不利影响，因此需要开发耐洪的卷心菜品种，以确保在面对极端天气事件时的可持续生产。因此，了解与卷心菜洪水胁迫相关的分子机制对于应对这一挑战至关重要。

为了了解埋伏条件下植物的基因调控机制，转基因品系被广泛用于遗传功能研究。然而，这种方法受到高成本、时间密集型转化和传代培养过程以及许多作物物种转化效率低的限制，因此需要开发替代方法。基于原生质体的瞬时表达系统已作为一种多功能且高效的替代方案广泛应用于植物分子研究。这些系统有助于研究启动子活性、响应环境线索的信号通路、蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA 相互作用以及亚细胞定位³。原生质体瞬时表达系统的建立不仅在模式植物 ^4,5 中也有报道，而且在具有重要经济意义的作物中也有报道，如甘蔗⁶、康乃馨⁷、蝴蝶兰 ⁸ 和茄子⁹。此外，这些系统已在木本植物中成功实施，包括 Camellia oleifera¹⁰和 Populus trichocarpa¹¹。然而，在淹没诱导的缺氧应激下应用原生质体系统研究叶菜的方案是有限的。因此，本研究为那些有兴趣使用卷心菜原生质体瞬时表达系统研究叶菜中缺氧反应的人开发了一种综合方案。

为了在细胞水平上执行浸没诱导的缺氧反应，在以前的研究中采用了几种除氧方法来模拟缺氧环境。这些包括使用 EC-Oxyrase、OxyFluor、亚硫酸钠和耗氧袋。EC-Oxyrase 通常用于人细胞系¹² 和拟南芥原生质体¹³ 中的厌氧处理。已发现 OxyFluor 可有效减轻活细胞荧光成像过程中活性氧引起的光漂白^14,15。亚硫酸钠已用于线虫的厌氧处理¹⁶，最近还用于水稻原生质体，与染色质免疫沉淀 （ChIP） 测定¹⁷ 等技术结合使用。主要用于厌氧细菌培养的脱氧剂包¹⁸也已证明在厌氧条件下诱导玉米原生质体中ZmPORB1启动子的激活¹⁹。

目前的工作旨在为卷心菜原生质体分离和瞬时表达建立稳健的管道。随后，通过使用双荧光素酶测定评估厌氧反应基因的启动子活性来评估各种氧调节治疗的疗效。本研究中开发的方案有望对未来与 Brassica 系统中的淹没或缺氧应激相关的研究具有价值。

研究方案

本研究使用了两个商业卷心菜 （B. oleracea var. capitata） 品种:'Fuyudori' 和 '228'。方案工作流程的图形表示如图 1 所示。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 卷心菜幼苗的制备

1. 使用商业植物基质将"Fuyudori"和"228"卷心菜种子播种到 48 孔插盘（长 49 厘米 x 宽 28 厘米 x 高 5 厘米）的圆形方形孔（深 4.5 厘米 x 高 4.5 厘米）中。将种子嵌入生长介质中约 1 厘米深。
2. 在 22 °C 的生长室中以 16/8 小时的明暗循环培养卷心菜幼苗。在光相期间保持 100 μmol m ^-2 ·s ^-1 （白色荧光灯管） 的光强度。
3. 生长 2-3 周后，使用 2 叶期的卷心菜幼苗进一步分离叶肉原生质体。
   注意:卷心菜幼苗的建议大小为 2 叶阶段，其中第二个真叶完全展开，但第三个真叶未展开，其长度短于 1 厘米（图 2A）。为了同步卷心菜幼苗的发育阶段，由于生长速度不同，"冬鸟"种子需要比"228"种子早播种大约 2 天。这种调整确保了卷心菜植株在所需阶段的均匀生长和成熟。

2. 卷心菜原生质体分离

1. 在每次原生质体分离之前准备 12.5 mL 酶溶液（表 1）。
   1. 用 10 mM MES （pH 5.7） 和 0.6 M 甘露醇在 55 °C 下预热溶液。 加入 1.5% 纤维素酶 R10 和 0.75% Macerozyme R10 后，继续在 55 °C 下加热溶液 10 分钟。
   2. 酶溶液冷却至室温 （25 °C） 后，加入 10 mM CaCl₂ 和 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA）。使用 0.22 μm 注射器过滤器将制备的酶溶液过滤到 9 cm 培养皿中消毒。
      注:溶液预热会增加酶的溶解度并使蛋白酶失活。消化效果因纤维素酶的不同类型而异。纤维素酶 R10 和 Macerozyme R10 的组合适用于卷心菜原生质体分离。
2. 从 5 到 8 棵卷心菜幼苗中收集第二片新扩展的真叶，并使用锋利的剃须刀片将它们切成 0.5-1.0 毫米的条状。立即将叶条转移到新鲜制备的酶溶液中。
   注意:在适当的阶段从卷心菜中选择健康和指定的叶子是至关重要的。来自 2 叶期卷心菜幼苗的第二个新扩展的真叶提供了最高的原生质体分离效率。不建议将过度成熟的植物、子叶或老化的叶子用于原生质体分离。5 到 12 片扩增良好的真叶可以在 12.5 mL 的酶溶液中成功产生卷心菜原生质体。原生质体分离所需的叶子数量取决于所需的原生质体数量。通常，从 5 到 8 片叶子中获得的原生质体足以用于后续的实验程序。
3. 在黑暗中真空渗透 30 分钟后（图 2B），将卷心菜叶条在室温下在黑暗中浸入酶溶液（图 2C）中再放置 4-16 小时。
   注意:酶消化时间可能因卷心菜品种而异，应根据特定基因型进行优化。例如，由于 "Fuyudori" 的叶子较厚，因此与 "228"（4 小时）相比，"Fuyudori"需要更长的消化时间（16 小时）。
4. 用等体积的 W5 溶液稀释含原生质体的溶液，该溶液由 2 mM MES （pH 5.7）、154 mM NaCl、125 mM CaCl₂、5 mM KCl 和 5 mM 葡萄糖组成，以停止酶消化。
5. 通过轻轻旋转或使用轨道摇床释放原生质体悬浮液。通过 70 μm 细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 锥形管中。
   注:分离的原生质体能够通过 70 μm 细胞过滤器，而未消化的植物碎片被过滤器保留，随后从悬浮液中去除。细胞过滤器可以重复使用，并在洗涤后保存在 75% 乙醇中，但必须在使用前用 W5 溶液充分冲洗细胞过滤器以去除残留的乙醇。
6. 将原生质体溶液在 4 °C 下用 150 x g 离心 2 分钟，然后小心地除去上清液。沿锥形管壁以大约 1 mL·s ^-1 的流速加入 10 mL 的 W5 溶液，轻轻洗涤沉淀的原生质体。在 4 °C 下以 150 x g 离心管 2 分钟，然后再次重复此洗涤程序以确保完全去除酶溶液。
7. 将原生质体重悬于 W5 溶液中，并将它们置于冰上 30 分钟。冰孵育后，用移液管一次 1 mL 去除上清液，直到去除所有上清液。
8. 将原生质体重悬于由 4 mM MES （pH 5.7）、0.4 M 甘露醇和 15 mM MgCl₂ 组成的冰预冷 MMG 溶液中（制备见 表 1 ）。
9. 用血细胞计数器测量原生质体浓度，并使用 MMG 溶液将最终浓度调节为 4 x 10⁵ 原生质体·^mL-1 。

3. 原生质体转染

1. 将总体积为 10 μL 质粒 （5-10 μg）（补充文件 1）与 100 μL 原生质体（4 x 10⁴ 原生质体）混合，置于冰上 10 分钟。
   注:对于转染级质粒纯化，按照制造商的说明使用市售的质粒试剂盒。大约 4 x 10⁴ 原生质体通常用于双荧光素酶报告基因测定。对于更大规模的实验，有更大量的原生质体可用于转染。具体而言，用 10 μg 质粒转染约 2 x 10⁵ 个原生质体的转染效率为 30% 至 40%。
2. 将等体积 （110 μL） 的新鲜制备的 PEG 溶液（制备见 表 1 ）加入原生质体溶液中 4000 （PEG4000）、0.1 M CaCl₂ 和 0.2 M 甘露醇，并轻轻混合。
3. 将原生质体混合物在室温下避光孵育 10 分钟，然后加入 440 μL W5 溶液终止反应。
4. 将转染的原生质体在 4 °C 下以 150 x g 离心 2 分钟，然后将沉淀重悬于 750 μL 富氧 W5 溶液中。将重悬的原生质体转移到预涂有 1% BSA 的 6 孔组织培养板中。
   注意:用于细胞孵育的 W5 溶液必须使用连接到气石的制氧机（~90% 氧气）与氧气一起鼓泡 5 分钟（图 2D）。在此氧化过程之后，W5溶液中的最终溶解氧浓度从7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 至 29.18 mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1，用溶解氧仪测量。用于重悬转染原生质体的 W5 溶液的体积取决于所使用的组织细胞培养板的类型。对于 12 孔或 24 孔细胞培养板，建议减少 W5 溶液的体积，以减轻孵育过程中由于孔内深度较深而导致的缺氧应激。对于 BSA 涂层，培养板的每个孔接受 1 mL 1% BSA 溶液，使其包被孔 10 秒。然后从每个孔中丢弃 BSA 溶液，随后用 W5 溶液重新填充孔。该程序旨在使用 BSA 创建一个临时的非粘附表面，有效防止原生质体在后续实验步骤中粘附在培养板的塑料表面。

4. 卷心菜原生质体的缺氧处理

1. 原生质体转染后立即进行化学或物理诱导的缺氧处理。
   注:建议在原生质体转染后立即进行缺氧处理。原生质体的长时间孵育可能会减少随后的缺氧反应。
   1. 对于卷心菜原生质体上的化学诱导缺氧，将 OxyFluor、EC-Oxyrase 和亚硫酸钠添加到 W5 原生质体溶液中。
      注:在 W5 中使用 0.6 单位·^mL-1 EC-氧氧酶、0.6 单位·^mL-1 氧氟和1 g·^mL-1 亚硫酸钠是能够诱导 BoADH1 和 BoSUS1L 启动子（图 3A）的测试条件，对两种检查的卷心菜品种的原生质体完整性损害低。
   2. 对于耗氧袋诱导的缺氧，将两个脱氧剂包放入 3.5 L 厌氧罐中，以创造缺氧环境。
2. 通过在 4 °C 下以 150 x g 离心 2 分钟来收获缺氧处理的原生质体。 使用液氮冷冻收集的原生质体，并将其储存在 -80 °C 冰箱中用于后续测定。

5. 双荧光素酶测定

1. 根据制造商的说明进行双荧光素酶报告基因测定，并稍作修改。
   1. 将卷心菜原生质体重悬于 50 μL 的 1x 被动裂解缓冲液中并涡旋 10 秒。
   2. 将破坏的原生质体在冰上孵育 10 分钟，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟后收集上清液。
   3. 向微孔板的每个孔中加入 20 μL 细胞裂解物。将 100 μL 荧光素酶检测试剂 II 分配到孔中，并使用酶标仪测量萤火虫荧光素酶活性。
   4. 向每个孔中加入 100 μL 市售检测试剂，并使用酶标仪测量海肾荧光素酶活性。

结果

这项工作成功地开发了一种利用卷心菜原生质体的瞬时表达系统（工作流程见图 1）。使用纤维素酶/macerozyme 消化和黑暗真空浸润（图 2B、C），从商业卷心菜品种 'Fuyudori' 和 '228' 的 2 至 3 周龄卷心菜真叶中分离出适当大小的原生质体（图 2A）。为了减轻浸没原生质体在孵育过程中经历的缺氧...

讨论

该方案提出了一种从两个商业卷心菜品种中分离原生质体的简化方法。该方法的有效性主要通过两个关键的质量控制参数来评估:活原生质体的产量和原生质体转染的效率。实施该方案导致产量超过 4.00 x 10⁶ 个原生质体·g⁻¹·来自两个卷心菜品种的叶肉组织的 FW（图 2E，F）。该产量与其他物种报道的产量相当，包括茄子?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation