JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

由于线粒体呼吸和生物能量学受到抑制，酒精滥用会损害肺泡巨噬细胞 （AM） 免疫力。我们最近证明，乙醇 （EtOH） 暴露会增加 AM 中线粒体呼吸的谷氨酰胺依赖性。在此，提供了使用细胞外通量生物分析仪确定谷氨酰胺在 EtOH 处理的 AM 中线粒体呼吸的用途的方法。

摘要

肺泡巨噬细胞 （AM） 是下气道中抵御病原体的第一道细胞防御线。然而，长期和过量饮酒会损害 AM 吞噬和清除肺泡腔病原体的能力，部分原因是燃料代谢和生物能量学失调。我们之前的工作表明，慢性乙醇 （EtOH） 消耗会损害线粒体生物能量学并增加 AM 中的乳酸水平。此外，我们最近证明 EtOH 增加了谷氨酰胺依赖性和谷氨酰胺依赖性最大呼吸，同时降低了柔韧性，从丙酮酸依赖性呼吸转向谷氨酰胺依赖性呼吸。当丙酮酸用于乳酸生产或其他燃料来源不足时，谷氨酰胺分解是线粒体呼吸的重要代偿途径。使用小鼠 AM 细胞系，MH-S 细胞，暴露于无 EtOH 或 EtOH （0.08%） 72 小时，我们使用细胞外通量生物分析仪确定了线粒体呼吸和生物能量学对谷氨酰胺作为燃料源的依赖性。对双-2-（5-苯乙酰酰胺-1,3,4-噻二唑-2-基）硫乙烷 （BPTES） 进行实时测量，BPTES 是谷氨酰胺酶 1 的抑制剂，可防止谷氨酰胺酶促转化为谷氨酸，在培养基载体中或单独响应载体，然后测试线粒体应激。此处提供的分步方案描述了我们用于分析谷氨酰胺依赖性基础线粒体呼吸、线粒体 ATP 相关呼吸、最大线粒体呼吸和线粒体备用呼吸能力的平均水平的方法和计算在多个生物学和实验重复中。

引言

酒精使用障碍 （AUD） 影响着美国超过 2800 万人1。AUD 患者患呼吸道感染的可能性要高 2-4 倍 2,3，从而增加过早发病和死亡的风险 3,4,5。酒精滥用增加了对呼吸道感染的易感性，部分原因是抑制了肺免疫功能。肺泡巨噬细胞 （AM） 是细胞抵御下肺病原体的第一道防线，它们吞噬并清除吸入的微生物。然而，长期饮酒会损害 AM 吞噬和杀死病原体的能力 6,7。

AM 的免疫功能（例如吞噬作用）是需要能量的过程，需要高三磷酸腺苷 （ATP） 生成所必需的代谢活性途径。线粒体氧化磷酸化是产生 ATP 的最有效细胞过程，但慢性乙醇 （EtOH） 暴露会增加线粒体衍生的氧化应激，这可能导致 AM 线粒体功能障碍 8,9,10。使用细胞耗氧率 （OCR） 测量的线粒体呼吸可以使用细胞外通量生物分析仪实时定量。响应寡霉素（ATP 合酶抑制剂）、羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙（FCCP，质子解偶联剂）和鱼藤酮/抗霉素 A（R/A，线粒体复合物 I 和 III 抑制剂）评估的线粒体呼吸曲线用于确定线粒体生物能量学。慢性 EtOH 会降低 AM 中的线粒体生物能量学，线粒体基础呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力减少证明了这一点10。

细胞对 ATP 产生的燃料来源（如丙酮酸、谷氨酰胺或脂肪酸）具有不同程度的依赖性。它们还具有一定程度的灵活性，因此它们可以改变燃料的使用来调节细胞生物能量学。谷氨酰胺分解是线粒体呼吸的关键途径，特别是当丙酮酸被分流到乳酸产生或脂肪酸不足时。我们最近的研究表明，慢性 EtOH 暴露会增加 AM 对谷氨酰胺的依赖性，并降低 AM 使用谷氨酰胺和其他燃料来源进行线粒体呼吸的灵活性11。这些结果，以及表明与用 UK5099 处理的培养基对照暴露的 MH-S 细胞相比，用丙酮酸氧化抑制剂 UK5099 处理 EtOH 暴露的 MH-S 细胞不会改变线粒体生物能量学的数据，表明 EtOH MH-S 细胞从丙酮酸依赖性呼吸转向谷氨酰胺依赖性呼吸。然而，这种转变不足以满足增材制造生物能量需求11。在此，我们描述了使用细胞外通量生物分析仪评估谷氨酰胺作为慢性 EtOH 暴露的 AM 中线粒体呼吸的燃料来源的方法。该方案针对 96 孔（11.04 mm2 面积）规格创建和优化，应针对更大的细胞培养孔大小进行调整。使用双-2-（5-苯乙酰酰胺-1,3,4-噻二唑-2-基）硫化乙酯（BPTES，谷氨酰胺酶 1 抑制剂）测定线粒体生物能量学的谷氨酰胺依赖性，以选择性抑制谷氨酰胺向谷氨酸的酶促转化。本研究中提供的数据是 Crotty 等人发表的未经处理的对照和慢性 EtOH 暴露小鼠 AM 细胞系 MH-S 细胞的培养基对照和 BPTES 处理实验组的额外生物学重复11。

研究方案

1. 体外慢性 EtOH 暴露

  1. 在含有 RPMI-1640 和 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素、11.9 mM 碳酸氢钠、40 mg/mL 庆大霉素和 50 μM 2-巯基乙醇的完全培养基中，在 37°C 和 5% CO2 的加湿培养箱中培养 MH-S 细胞，一种小鼠肺泡巨噬细胞系。
  2. 用或不用 EtOH（0.8 mg/mL 或 0.08%）处理培养的 MH-S 细胞 72 小时，其中 EtOH 应每 24 小时更换一次。将 EtOH 处理的 MH-S 细胞在 37 °C 下与 5% CO2 在单独的加湿培养箱中孵育，培养箱水中含有 0.08% EtOH。

2. 接种 MH-S 细胞，以使用细胞外通量生物分析仪评估谷氨酰胺作为燃料源

  1. 确保未处理的对照 （Con） 和慢性 EtOH 处理的 MH-S 细胞在 T-75 培养瓶中生长至至少 50% 汇合（70%-90% 汇合是理想的），以传代到 96 孔细胞外通量微培养板中。为每个 Con 和 EtOH 实验条件的生物重复和每种培养基对照准备 5-6 个技术重复的板图，以与 BPTES 注射进行比较（生物学 n = 1 共四组）。
  2. 用培养基或磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞。
  3. 向培养瓶中加入 6 mL 含血清的培养基。
  4. 刮擦细胞，直到它们脱落并且板的底部是透明的。胰蛋白酶不是 MH-S 细胞分离所必需的，但可能对其他细胞类型有帮助。
  5. 使用血清移液管或 1 mL 移液管分离细胞。
  6. 将悬浮细胞转移到 15 mL 锥形管中，并以 200 x g 离心 6 分钟。
  7. 吸出上清液。
  8. 加入 1 mL 培养基并彻底重悬细胞。
  9. 将 10 μL 转移至微量离心管中，加入 10 μL 台盼蓝。搅拌均匀。
  10. 将 10 μL 细胞/台盼蓝混合物转移到血细胞计数器或细胞计数器的一侧。
  11. 使用光学显微镜或细胞计数器计数细胞数。
  12. 将细胞密度计算为每毫升的平均活细胞计数。
  13. 计算所需的稀释度:
    所需孔数 x 10000-15000 个细胞 = 所需细胞总数。
    所需孔数 x 80 μL = 所需重悬细胞的总体积。
  14. 将 80 μL 细胞加入 96 孔细胞外通量微培养板的必要孔中。
  15. 让角落孔完全没有任何细胞或培养基。这些孔将用于背景测量。
  16. 将细胞在 37 °C 加湿培养箱中用 5% CO2 孵育过夜，以使细胞在细胞外通量微培养板中粘附和平衡。
  17. 使用步骤 1 在 96 孔细胞外通量微培养板中处理 MH-S 细胞 72 小时。
  18. 在运行细胞外通量生物分析仪实验前至少 4 小时至 24 小时，水合 96 孔细胞外通量 pak 小柱。
    1. 去除细胞外 Flux pak 的顶部，并将 Flux pak 的探测部分正面朝上放在工作台上。将 200 μL 细胞外通量校准液涂抹到细胞外 Flux pak 小柱底部的每个孔中。
    2. 将切片放在一起，并将细胞外 Flux pak 盒包裹在封口膜中。将其置于 37 °C 非 CO2 加湿培养箱或 37 °C 珠浴中。
  19. 打开包含分析设计的计算机，打开连接到细胞外通量生物分析仪仪器的运行/分析软件，使其在进行实验前至少预热 4 小时。

3. 使用细胞外通量生物分析仪评估谷氨酰胺作为 MH-S 细胞中线粒体呼吸的燃料来源

注意:此过程的一般概述如图 1 所示。

  1. 在光学显微镜下检查 Con 和 EtOH 处理的培养 MH-S 细胞，并确保细胞健康并粘附在单层孔中。确保细胞至少达到 70% 汇合度（90% 汇合度是理想的）以可靠地进行检测。
  2. 使用以下补充剂制备细胞外通量基础培养基:
    1. 将 35 mL 细胞外通量基础培养基分装到 50 mL 试管中。
    2. 加入 350 μL 100 mM 丙酮酸钠（1 mM 终浓度）、350 μL D-葡萄糖（10 mM 终浓度）和 350 μL GlutaMAX，与 L-谷氨酰胺（2 mM 终浓度）相比，其更耐储存。
      注意:新鲜的 L-谷氨酰胺也可以以相同浓度使用。
    3. 将溶液加热至 37 °C，并确保 37 °C 时的 pH 值为 7.4 ± 0.05。
  3. 轻轻地从细胞外微培养板中吸出生长培养基。留下尽可能少的培养基，不要从底部吸出细胞。用最多 50 μL 补充细胞外助焊剂的基础培养基洗涤一次。
  4. 向每个孔中加入 180 μL 补充细胞外通量的基础培养基，并将细胞外微培养板在 37 °C 非 CO2 加湿培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时以达到平衡。
  5. 溶解谷氨酰胺氧化试验试剂:
    1. 在 BPTES 管中，加入 700 μL 补充细胞外通量的基础培养基，制成 120 mM 储备液。上下移液 10 次以适当溶解化合物。
      注意:BPTES 会引起皮肤和眼睛刺激，并可能引起呼吸道刺激。处理时戴上防护手套、护目镜和面部防护装置。将内容物和容器丢弃到经批准的废物处理设施。
    2. 在寡霉素管中，加入 630 μL 补充细胞外通量的基础培养基，制成 100 mM 储备溶液。上下移液 10 次以适当溶解化合物。
    3. 在 FCCP 管中，加入 720 μL 补充细胞外通量的基础培养基，制成 100 mM 储备液。上下移液 10 次以适当溶解化合物。
      注意:吞咽 FCCP 有害，会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤，可能引起皮肤过敏反应，并可能对水生生物造成长期的有害影响。处理时戴防护手套、防护服、护目镜和面罩。将内容物和容器丢弃到经批准的废物处理设施。
    4. 在 R/A 管中，加入 540 μL 补充细胞外通量的基础培养基，制成 50 mM 储备液。上下移液 10 次以适当溶解化合物。
      注意:鱼藤酮如果吞咽或吸入是致命的，会引起皮肤刺激，引起严重的眼睛刺激，可能引起呼吸道刺激，并且对水生生物具有很强的毒性，具有长期影响。戴防护手套、护目镜、面罩和呼吸防护装置。将内容物和容器丢弃到经批准的废物处理设施。吞咽抗霉素 A 是致命的，并且对水生生物毒性很大，具有长期影响。将内容物和容器丢弃到经批准的废物处理设施。
  6. 制备工作浓度的底物氧化和线粒体压力测试试剂:
    1. 对于 BPTES，将 1,500 μL 补充细胞外通量的基础培养基与 500 μL 120 mM BPTES 储备液混合，制成 30 μM BPTES 工作溶液。
    2. 对于寡霉素，将 2,520 μL 补充细胞外通量的基础培养基与 480 μL 100 mM 寡霉素混合，制成 16 mM 寡霉素工作溶液。
    3. 对于 FCCP，将 2,865 μL 补充细胞外通量的基础培养基与 135 μL 的 100 mM FCCP 混合，制成 4.5 mM FCCP 工作溶液。
    4. 对于 R/A，将 2,700 μL 补充细胞外通量的基础培养基与 300 μL 的 50 mM R/A 混合，制成 5 mM R/A 工作溶液。
  7. 在细胞外 Flux pak 小柱的上部端口上装入以下物品:
    1. 将 20 μL 补充细胞外通量的基础培养基加载到端口 A 中，将 22 μL 寡霉素加载到端口 B，将 25 μL FCCP 加载到端口 C，将 27 μL R/A 加载到端口 D 中。
    2. 将含有细胞的孔中加入 20 μL 培养基对照或 BPTES 加载到端口 A（BPTES 终浓度为 3 μM）中，将 22 μL 寡霉素加载到端口 B 中（寡霉素终浓度为 2 μM），将 25 μL FCCP 加载到端口 C（FCCP 终浓度为 0.5 μM）中，将 27 μL R/A（R/A 终浓度为 0.5 μM）加载到端口 D。
  8. 使用以下定时和注射策略，使用连接到仪器的计算机软件程序进行细胞外通量生物分析仪实验，该程序用于检测设计和分析:
    1. 对于 BPTES 的端口 A 进样，将测量次数设置为 6。将混合时间设置为 3 分钟，等待时间为 0 分钟，测量时间为 3 分钟。
    2. 对于寡霉素的端口 B 进样，将测量次数设置为 3。将混合时间设置为 3 分钟，等待时间为 0 分钟，测量时间为 3 分钟。
    3. 对于 FCCP 的端口 C 进样，将测量次数设置为 3。将混合时间设置为 3 分钟，等待时间为 6 分钟，测量时间为 3 分钟。
    4. 对于 R/A 的端口 D 的进样，将测量次数设置为 3。将混合时间设置为 3 分钟，等待时间为 0 分钟，测量时间为 3 分钟。
    5. 查看所有设置的背景、培养基对照和实验组孔。保存并运行检测。首先，用 A-D 注射加载细胞外通量 pak。校准将进行，直到细胞板准备好加载。
    6. 检测结束时立即取出细胞板。保存结果以便稍后在其他设备上进行分析。
    7. 使用光学显微镜检查细胞是否仍然粘附。用磷酸盐缓冲盐水洗涤 1 次，并用首选的细胞裂解缓冲液裂解细胞。储存在 -80 °C 或立即测定蛋白质浓度。

4. 评估谷氨酰胺作为 MH-S 细胞中线粒体呼吸燃料来源的结果分析

  1. 从每个孔中的细胞中提取蛋白质，以将耗氧率 （OCR） 数据标准化为蛋白质:
    1. 计算每孔蛋白质的浓度（纳克/微升 [ng/μL]）。
    2. 计算整个细胞外通量微培养板的平均蛋白质浓度 （ng/μL）。
    3. 将每个孔的蛋白质浓度除以平均板的蛋白质浓度，得到归一化因子。
    4. 使用计算机软件程序将归一化因子应用于感兴趣的数据文件，以进行分析设计和分析。
  2. 确保所有背景孔的 OCR 值都接近 0。
  3. 取消选择基线时 OCR < 10 的任何细胞孔。数据不会被删除，但高亮显示的井将显示在导出的数据文件中。
  4. 将用于分析设计和分析的计算机软件程序中的数据导出到计算机电子表格程序中。
  5. 在计算机电子表格程序中打开文件，并通过减小 OCR 的值对所有数据进行排序。删除背景孔、先前取消选择（且尚未删除）的孔、任何细胞活力低的孔、细胞汇合度低的孔、未完成完全进样策略的孔、蛋白质浓度读数不准确的孔、基线 OCR < 10 的孔以及任何其他预定标准。
  6. 按测量、组和 OCR 对所有剩余数据进行排序。
  7. 通过测量独立地平均每个生物 N 的技术重复。确保每个实验组在平均技术重复后每个生物 N 至少有 18 个不同的值（3 个基线，培养基/BPTES 后 3 个，寡霉素后 3 个，FCCP 后 3 个，鱼藤酮/抗霉素 A 后 6 个）。分别对每个生物 N 执行此作，以便稍后可以计算分析数据的平均标准差或标准误差。
  8. 将所有平均值复制到新的电子表格中，按实验组分隔。
  9. 每个实验组中按注射策略平均 OCR 值。
  10. 根据耗氧量计算线粒体生物能量学的参数:
    1. 计算基础呼吸:
      1. 计算基础线粒体呼吸如下:
        基础线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #1、2、3 - 平均 OCR 测量值 #16、17、18] x [时间 #3 - 时间 #1]）
        注:培养基对照组和 BPTES 组之间的基础呼吸应相似，因为这是在注射抑制剂之前。
      2. 计算不依赖于谷氨酰胺的基础线粒体呼吸，如下所示:
        不依赖于谷氨酰胺的基础线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #4、5、6、7、8、9 - 平均 OCR 测量值 #16、17、18] x [时间 #9 - 时间 #4]）
        注意:不依赖于谷氨酰胺的基础线粒体呼吸应小于基础线粒体呼吸，除非细胞不严重依赖谷氨酰胺。
      3. 计算依赖于谷氨酰胺的基础线粒体呼吸，如下所示:
        依赖于谷氨酰胺的基础线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #1、2、3 - 平均 OCR 测量值 #4、5、6、7、8、9] x [时间 #9 - 时间 #4]）
        注意:不应从基础线粒体呼吸中减去总基础线粒体呼吸，也不应依赖于谷氨酰胺，因为这些是在不同的时间点计算的。
    2. 计算 ATP 相关呼吸如下:
      1. 计算所有燃料的总线粒体 ATP 相关呼吸，如下所示:
        来自所有燃料的总线粒体 ATP 相关呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #1、2、3 - 平均 OCR 测量值 #10、11、12] x [时间 #12 - 时间 #10]）
        注意:培养基对照组和 BPTES 组之间测量 #10、11 和 12 的平均 OCR 应该相似，因为寡霉素应强烈抑制 ATP 合酶，并且抑制一种燃料途径不应改变总 ATP 相关呼吸。
      2. 计算不依赖于谷氨酰胺的 ATP 连接的线粒体呼吸，如下所示:
        不依赖于谷氨酰胺的 ATP 相关线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #4、5、6、7、8、9 - 平均 OCR 测量值 #10、11、12] x [时间 #12 - 时间 #10]）
        注意:不依赖于谷氨酰胺的 ATP 连接的线粒体呼吸应小于 ATP 连接的线粒体呼吸，除非细胞不严重依赖谷氨酰胺。
      3. 计算依赖于谷氨酰胺的 ATP 连接的线粒体呼吸，如下所示:
        依赖于谷氨酰胺的 ATP 相关线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= 来自所有燃料的 ATP 相关线粒体总呼吸 - ATP 相关线粒体呼吸不依赖于谷氨酰胺
    3. 按如下方式计算最大呼吸:
      1. 计算总最大线粒体呼吸如下:
        总最大线粒体呼吸（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #13、14、15 - 平均 OCR 测量值 #16、17、18] x [时间 #15 - 时间 #13]）
      2. 计算不依赖于谷氨酰胺的最大线粒体呼吸，如下所示:
        最大线粒体呼吸不依赖于谷氨酰胺（消耗的 pmol O2 ）= （[BPTES 组的平均 OCR 测量 #13、14、15 - BPTES 组的平均 OCR 测量 #16、17、18] x [时间 #15 - #Time 13]）
      3. 计算取决于谷氨酰胺的最大线粒体呼吸，如下所示:
        最大线粒体呼吸取决于谷氨酰胺（消耗的 pmol O2 ）= 来自所有燃料的最大线粒体总呼吸 - 最大线粒体呼吸不依赖于谷氨酰胺
        注:与其他燃料相比，此计算可用于确定谷氨酰胺备用容量的细胞依赖性。最大线粒体呼吸越大，对谷氨酰胺的依赖性就越大，谷氨酰胺可以表示为 BPTES 组 - 对照组显示最大线粒体呼吸的损失或占总呼吸的百分比。
    4. 按以下方式计算备用呼吸量:
      1. 按如下方式计算总备用呼吸量:
        总备用呼吸量（消耗的 pmol O2 ）= （[平均 OCR 测量值 #13、14、15 - 平均 OCR 测量值 #1、2、3] x [时间 #15 - 时间 #13]）
      2. 计算不依赖于谷氨酰胺的备用呼吸量如下:
        不依赖于谷氨酰胺的备用呼吸量（消耗的 pmol O2 ）= （[BPTES 组的平均 OCR 测量值 #13、14、15 - BPTES 组的平均 OCR 测量值 #1、2、3] x [时间 #15 - 时间 #13]）
      3. 根据谷氨酰胺计算备用呼吸量，如下所示:
        取决于谷氨酰胺的备用呼吸量（消耗的 pmol O2 ）= 所有燃料的总备用呼吸量 - 不依赖于谷氨酰胺的备用呼吸量
        注:此计算表示依赖于谷氨酰胺的细胞的灵活性，以及它们是否可以在需要时在没有谷氨酰胺的情况下实现更大的呼吸作用。
  11. 按抑制剂组减去培养基对照，如果需要，将相对于对照组消耗的 pmol O2 标准化。
  12. 创建依赖于谷氨酰胺的 OCR 生物能量曲线 （pmol O2/min）、基础呼吸 （pmol O2）、ATP 相关呼吸 （pmol O2）、最大呼吸 （pmol O2） 和备用呼吸能力 （pmol O2） 的图表。
  13. 在条形图中描述线粒体生物能量终点值，或表示为相对于培养基对照组的抑制剂组的平均值。如果每个生物 N 都是单独计算的，则计算所有生物 N 的分析数据的标准差或平均值的标准差或标准误差。

5. 统计分析

  1. 使用适当的数据分析软件执行所有统计分析。
  2. 对于 OCR 生物能量谱的线性点，执行双向方差分析，然后进行 Tukey 事后分析，以将这四个实验组的数据与两个因素（处理和注射策略）进行比较:Con + 培养基、Con + BPTES、EtOH + 培养基和 EtOH + BPTES。
  3. 对于依赖于谷氨酰胺的基础呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力的条形图，进行学生 t 检验分析以比较来自两个实验组（Con + BPTES 和 EtOH + BPTES）的数据。
  4. 将数据表示为均值±均值的标准误差 （SEM）。考虑 p < 0.05 具有统计显著性。

结果

慢性 EtOH 暴露可降低 MH-S 细胞中的谷氨酰胺依赖性。
谷氨酰胺分解是线粒体呼吸的关键途径，支持谷氨酰胺成为细胞生物能量学的重要燃料来源。为了确定长期暴露于 EtOH 是否会改变 MH-S 细胞对谷氨酰胺作为线粒体呼吸燃料来源的依赖性，MH-S 细胞在没有 EtOH 对照 （Con） 或 EtOH 的情况下处理，并随着时间的推移测量 OCR 响应于连续注射与线粒体呼吸相关的...

讨论

此处提供的数据是用培养基对照或 BPTES 处理的未处理和慢性 EtOH 暴露的 MH-S 细胞的额外生物学重复，发表在 Crotty 等人11 中。所描述的方案用于评估 EtOH 暴露的 MH-S 细胞对谷氨酰胺作为线粒体呼吸和生物能量学燃料来源的依赖性，使用细胞外通量生物分析仪。该协议中有几个关键步骤。首先，MH-S 细胞的形成和汇合很重要。MH-S 细胞最初以低汇合度在细?...

披露声明

所有作者都没有任何相关的财务利益冲突需要报告。

致谢

我们感谢 Sarah S. Chang BS 对初始细胞培养和制备用于实验的 MH-S 细胞的贡献。这项工作得到了 NIAAA R01-AA026086 到 SMY （ORCID: 0000-0001-9309-0233）、NIAAA F31-F31AA029938 到 KMC 和 NIGMS T32-GM008602 到埃默里大学药理学和化学生物学系 Randy Hall 的支持。本报告的内容不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tube VWR International, Inc.21008-670Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich Co.M6250Used for culturing MH-S cells.
Cell scraperDot Scientific, Inc.70-1180Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counterFisher Scientific CompanyAMQAF2000Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose Sigma Aldrich Co.G8270Used for the extracellular flux base medium.
EthanolFisher Scientific Company4355720Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serumSciencell Research Laboratories500Used for culturing MH-S cells.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-2019Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube USA Scientific, Inc.4036-3212Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet programMicrosoftN/ASoftware for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycinFisher Scientific Company15140122Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered salineVWR International, Inc.45000-446Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysisAgilent Technologies, Inc.N/AThe computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test KitAgilent Technologies, Inc.103674-100Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzerAgilent Technologies, Inc.N/AExtracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solutionAgilent Technologies, Inc.102416-100Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonateSigma Aldrich Co.S6014Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate Sigma Aldrich Co.P4562Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasksSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Used for culturing MH-S cells.

参考文献

  1. . 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021 Available from: https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021)
  2. Everts, R. J., et al. Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital. N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).
  3. de Roux, A., et al. Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia. Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).
  4. Moss, M. Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse. Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).
  5. Fernandez-Sola, J., et al. High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia. Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).
  6. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).
  7. Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).
  8. Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction. Biomed Res Int. 2014, 371593 (2014).
  9. Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages. Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).
  10. Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4. Alcohol. 90, 27-38 (2021).
  11. Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).
  12. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  13. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  14. Chacko, B. K., et al. The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).
  15. Fan, Y., et al. Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology. STAR Protoc. 4 (1), 102073 (2023).
  16. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protoc. 2 (1), 100245 (2021).
  17. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  18. Winnica, D., et al. Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets. Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).
  19. Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity. Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).
  20. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
  21. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health. Redox Biol. 10, 65-77 (2016).
  24. Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology. Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).
  25. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. 46, e2511 (2010).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  27. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  28. Yeligar, S. M., et al. PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).
  29. Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199. J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).
  30. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Alcohol. 106, 30-43 (2023).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

BPTES ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。