使用CyDye DIGE Fluor公司最小染料的细胞表面蛋白的选择性标签

摘要

一个简单的和具体的方法是没有分馏步骤细胞表面蛋白的荧光标记和增强检测证明。差分在细胞表面的蛋白质丰度使用的二维（2 - D）电泳和Ettan™DIGE技术进行了分析。

摘要

表面蛋白是细胞的反应能力，它的环境，与邻近的细胞相互作用的核心。它们是已知的几乎所有的细胞内信号诱导。此外，他们在环境适应和药物治疗发挥重要作用，而且往往在疾病的发病机制和病理（1）参与。蛋白质 - 蛋白质相互作用的内在信号通路，并获得更深入地了解这些复杂的生物过程，需要敏感和可靠的方法是研究细胞表面的蛋白质。二维电泳（2 - D）是广泛用于复杂的蛋白质样品中的生物标志物和其他目标的检测，研究差的变化。细胞表面蛋白，部分原因是由于他们的低丰度（1 2％的细胞蛋白），是很难检测到，没有分馏或一些其他类型的浓缩在一个2 - D凝胶。他们也往往不佳的2 - D凝胶，由于其疏水性和超高分子量（2）表示。在这项研究中，我们提出一个新的协议为使用这种蛋白质的重要​​的一组特定的标签和检测CyDye DIGE Fluor公司最小的染料的完整细胞。结果表明：大量的细胞表面蛋白与细胞内蛋白质的最小标签的具体标注。此协议是快速，简单易用，所有三个CyDye DIGE Fluor公司（赛扬2，赛扬3和CY 5）最小的染料，可用于标记细胞表面蛋白。这些特性允许复用的2 - D荧光差异凝胶电泳（2 - D DIGE）Ettan DIGE技术和使用DeCyder的2 - D差异分析软件蛋白表达变化的分析。随后在CHO细胞中不同的时间长度（见表1）血清饥饿的细胞表面蛋白的水平。丰富的小变化，具有精度高，检测结果是由定义的统计方法的支持。

研究方案

细胞培养

1. 种植中国仓鼠卵巢细胞（CHO - K1）使用标准细胞培养过程中的F - 12火腿中含10％小牛血清，50 U / ml青霉素，50μg/ ml的硫酸链霉素（Invitrogen公司）与GlutaMAX我。
2. 交易所培养基，无血清培养基。标签的细胞表面蛋白CyDye DIGE Fluor公司Cy3标记或Cy5最小的染料（见部分细胞表面标记 ，下面）在不同的时间点。
3. 从各时间点和CyDye DIGE Fluor公司CY2标签细胞的数目相等的池。使用这些内部标准为每一个2 - D凝胶。
4. CHO - K1细胞进行的实验都可以，但小鼠胚胎成纤维细胞（3T3 L1）和小鼠腹水淋巴瘤淋巴母细胞（EL4）也可以使用（数据未显示）。
5. 成长与GlutaMAX第二DMEM培养基中的两个后一种类型的细胞，但是，否则，使用相同的条件下使用的CHO - K1细胞。

细胞表面的标签

1. 仔细非酶解，分离贴壁细胞计数和到5-10 x106细胞等份划分。对于悬浮液中生长的细胞，省略了分离步骤。
2. 离心5分钟，约800 XG的细胞悬液。含介质取出上清液。
3. 1毫升冰冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）pH值8.5 resuspendion洗净颗粒。离心800 XG在4 ° C时2分钟。
4. 去除上清，悬浮细胞沉淀（pH值8.5的HBSS，1 M尿素）200μL冰冷的标签缓冲区。
5. 标签完整的细胞，与600 pmol CyDye DIGE Fluor公司最少为20分钟，在黑暗中冰染料。
6. 淬火加入20μL10毫米赖氨酸的反应。孵育10分钟。
7. 两次在500μL的HBSS pH值7.4，在4 ° C时2分钟离心800 XG洗净再悬浮的表面标记的细胞。

细胞裂解和分馏

1. 在150μL冷裂解液（7 M尿素，硫脲2米，4％CHAPS，30毫米三，5毫米醋酸镁的pH值8.5）的表面标记的细胞裂解。冰离开至少1 h偶有震荡。
2. 离心机在10 000 XG的细胞裂解液在4 ° C 5分钟。将上清转移至新管。此示例的非分割的样本包含了所有的细胞蛋白。
3. 与此同时，洗细胞沉淀，如上，然后分馏（使用的膜分离组件，皮尔斯）到细胞膜和细胞质组分之前的2 - D凝胶电泳。膜分数包含内部和细胞表面的膜蛋白。
4. 相比较而言，遵循的标准Ettan DIGE过程^3，和裂解，标签，和，最后，分馏的细胞。确定在使用2个样品的蛋白质浓度 - D定量试剂盒（GE医疗）。

2 - D电泳

1. 补充水分Immobiline DryStrip凝胶，pH值3 - 11NL（24厘米）使用Immobiline DryStrip Reswelling纸盒，24厘米在450μLDeStreak补液盐（0.5％IPG缓冲）过夜。
2. 应用CyDye标记的样本（相当于50μg总蛋白）Immobiline在多方面的阳极杯加载DryStrip凝胶和执行等电聚焦（IEF），根据指示使用Ettan IPGphor II等电聚焦系统。
3. 国际盛事基金，平衡后的带两个步骤和大（26 × 20厘米）12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）上进行。运行缓冲液含有溴酚蓝）与0.5％的琼脂糖覆盖（。运行2 - D电泳使用Ettan DALTtwelve大型垂直系统在5 / 30分钟凝胶，然后在15瓦/凝胶，直到染料前沿到达凝胶底部。

成像和数据分析

1. 完成2 - D电泳后，凝胶，使用一个台风9410可变模式成像扫描CY2，Cy3标记或Cy5。
2. 比较膜组分，细胞质组分和非分割的样品使用DeCyder的2 - D差异分析^软件 4现场的地图。

染色后

1. 成像后，银染凝胶，按照标准^程序 5 。

蛋白质鉴定

1. 种植，收获，清洗和裂解制备金额（约1毫克总蛋白的10 x106 CHO细胞）的细胞，作为一个非分割的样本以上。使用作为秒杀一个Cy5的细胞表面标记的样本（见上文），并适用于蛋白质的不知名的制备金额一起。
2. 开展上文所述的2 - D电泳，但这个时候，aplly 600微克未标记的细胞裂解液50微克的细胞表面标记的阳极杯应用穗。使用参考标记，以便正确的现场采摘，到位之间的凝胶铸造前玻璃板根据建议^3。
3. Cy5的通道扫描凝胶获得了Cy5的细胞表面的现场图，总蛋白染色用深紫色的总蛋白染色^3。
4. 搭配在一起的两个当场地图使用DeCyder 2 - D软件，并创建一个对应的赛扬5标记的细胞表面蛋白的所有景点的选择列表。选择使用Ettan当场处理站的细胞表面蛋白，提取凝胶插头，trypsinate使用Ettan沼气池。确定使用MALDI - TOF质谱。

表1。Ettan DIGE实验使用耗尽标记的细胞表面蛋白在图1的标签协议，从血清细胞样本。

样品	血清枯竭的时间	标记的与CyDye	凝胶数量
1	-	赛扬3，赛扬2	1
2	30分钟	5赛扬，赛扬2	1
3	2个小时	赛扬3，赛扬2	2
4	4个小时	5赛扬，赛扬2	2
5	16个小时	5赛扬，赛扬2	3

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讨论

蛋白质浓度

概述两个标签工作流程如图1所示。根据细胞表面蛋白标签协议标记时，由于细胞仍然完好，只在细胞表面的蛋白质暴露的染料。在标准Ettan DIGE协议，细胞裂解之前，标签和内以及在细胞外的蛋白质标记（图1）。染料相对量的蛋白质在细胞表面的蛋白标记协议是不知道，因为细胞表面蛋白无法具体定量分析。然而，它是已知的细胞表面蛋白²细胞蛋白构成的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122