改进的膜片钳记录的压力抛光移液器

摘要

这是一个指导修改形状的玻璃微量。具体来说，通过热和空气压力的锥度不增加尖端张开扩大，导致较低的吸液管电阻。这是至关重要的，以获得小细胞低噪音录音，但在许多应用中非常有用。

摘要

压力抛光塑造膜片钳记录玻璃移液器的方法。首先，我们开发了适合小（<3米）的神经元细胞体的录音编造移液器此方法。基本原理是类似玻璃吹制，并结合空气的压力和热量，修改形状由传统的微量车夫准备的补丁移液器。它可以应用到所谓的软（碱石灰）和硬（硼硅）眼镜。一般来说，抛光压力，可以减少25％，吸液管电阻不减少的尖端张开“（Goodman和Lockery，2000）直径。它可以适用于几乎任何类型的玻璃，只需要增加一个高压阀门及配件一个microforge。这种技术是必要的记录，从超小细胞（<5米）和，还可以通过单声道录音，最大限度地减少吸液管电阻。钝的形状也很有用穿孔膜片钳记录，因为这在一个较大的膜穿孔的气泡的笔尖形状结果。

研究方案

拉移液器

使用灯丝一个车夫，如萨特的P - 97火焰山/布朗微电极拖轮，拉约10-20移液器。

1. 选择你的玻璃。我们使用硼硅（BF150 - 86 - 10，OD = 1.5毫米，编号= 0.86毫米）。商店的玻璃，仔细，所以保持清洁和无尘。
2. 设计一个拉动的程序。其主要目的是尖端张开约所需的大小，这将取决于应用程序。萨特的 P - 97移液器食谱 ²是一个很好的参考。
3. 在显微镜下观察确定开口直径和平滑的移液器。舍弃粗糙，凹凸不平，或不规则的小窍门。对于标准的膜片钳记录，是2-4微米跨越的小费开放是最好的。一个先端钝，导致较低的电阻相同的开口直径，这是首选。形状和大小，在抛光过程中，可以修改如下。

压力抛光移液器

1. 将吸管持有人一个干净，压缩空气。使用稳压器，设置压缩空气〜40 PSI压力。 4路控制阀，使吸管持有人的压力，要打开和关闭连接的压缩空气。 ⅛®管长度在聚乙烯吸管持有人连接到控制阀。
2. 使用一个高压力吸管架，抛光线圈由一个脚踏，配备低和高放大倍率，长工作距离（理想情况下，10X和100X）空中目标显微镜控制抛光钻机（microforge）。它是重要的是要能够观察到在协议吸管开放。
3. 可选 ：涂层具有疏水性的绝缘体，以减少电容和改善噪声特性（见“拉移液器”这种技术）的吸管。
4. 验证压力阀在关闭的位置。吸管放入吸管持有人，并用手指拧紧拧紧接头。
   
   安全注意事项 ：如果移液器吸管持有人持有的紧密，空气压力会导致移液器移液器支架弹出。
   
   
5. 将在microforge的移液器和持有人。位置显微镜舞台上的吸管持有这样既尖和抛光线圈microforge电源低（10倍）可见。带来的长丝的一角〜75微米。请记住，灯丝加热时，将扩大。
6. 切换到高功率（100倍）的目标。枪头和抛光线圈应在重点和视野。如果不是，调整抛光线圈的高度。 （吸管的位置，无法调整）。枪头和抛光线圈应靠近两侧的视野。避免定位线圈太近，因为它会扩大，因为它加热到您的移液器和凹凸的枪头 。
7. 打开阀门，直接加压空气进入移液器，枪头，直到热背后的尖端锥度开始向外气球。
8. 停止加热前提示气球太广泛。实验是必需的，以确定适当的距离，热量和时间，所需的形状。
9. 可选 ：抛光的提示，在没有压力的情况下，减少尖端张开直径。步骤7和8可以反复微调的形状和尺寸的枪头。
10. 关闭的压力，同时指出在一个安全的方向的枪头，取出吸管，并放置在一个干净的储物盒，将防尘。
    
    安全注意事项 ：如果不关闭，气压吸管吸管持有人可在取出弹出。

注意事项的microforge

我们使用过的，现成的市售零件组装一个microforge。 （您也可以购买由少数几家公司，如ALA的科学，GlassWorx压力抛光套件）。不管的microforge，它是必不可少的，有不够好，看到提示开放，这常常是一个直径只有几微米的光学。为此目的，我们使用长工作距离的100倍镜头。此外，大衣抛光线圈，以尽量减少高熔化温度，以玻璃上沉积的移液器汽化的金属。

第3部分：预期结果

适度的压力抛光，可以减少没有明显变化，在开口直径的吸液管的阻力。如果需要，该协议可用于亚微米开口与5 -10MΩ电阻移液器。

讨论

我们最初开发这种方法使移液器有用2-3μm的神经元在 C片钳记录线虫 ^1。它是在古德曼实验室常规使用。我们的压力不仅波兰移液器录制从微小的C。线虫的神经元，但也获得macropatch表示在爪蟾卵母细胞的离子通道和单通道录音。对于一个给定的尖端开口直径，生硬的造型产生一个低电阻的吸管。下吸液管电阻会导致较低的串联电阻和低噪声录音。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve