离子交换色谱法

1.准备样品和列

1. 在这个演示中，一种 2 蛋白混合物将阳离子交换柱上分离: 血红蛋白和细胞色素 C.添加 0.2 毫升平衡缓冲 (pH 8.1) 蛋白样品和涡拌匀。2 分钟要删除任何泡沫的离心机。
2. 阳离子交换柱置于试管 5 分钟，使树脂来解决。夹紧测试管柱上环站，以确保它是直立。
3. 打开顶盖的列，然后底部的上限。滴出来进试管的重力作用下的列中允许的缓冲区。
4. 洗两次列列-卷 （在这种情况下，列卷是 0.3 毫升） 的平衡缓冲区。添加第二个列卷之前的平衡缓冲滴出入废瓶让第一列卷 （0.3 毫升）。这一步让平衡与平衡缓冲区的列。在这一步，不打扰树脂慢慢添加平衡缓冲区。

2.运行蛋白样品通过阳离子交换柱

1. 将列放在标记为"未绑定 1"2 毫升离心管中。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。
2. 一旦样品已加载到列的顶部，用冲洗 0.3 毫升的平衡缓冲区在列的顶部添加缓冲区并允许它滴，一路过关斩将。重复此步骤 4 x （共 5 洗） 并收集每个洗在单独、 2 毫升离心管中。标记为"未绑定 1 5"管。
3. 为最后 2 洗、 离心 10 s 1,000 x g，以确保所有未绑定的物种脱落的列。任何将绑定到列的样品不应在这些洗，但并不受约束的示例将洗不。离心提供更多的力量来洗未绑定列的材料。
4. 提出一种新型的标记的 2 毫升离心机集合管"绑定 1"的列。把 0.3 毫升的洗脱缓冲液 (高盐，pH 5.5) 放在上面的列。离心机产生的淋洗液为 10 1,000 x g s。
5. 通过将列放置在新的离心管，加入 0.3 毫升，重复洗脱步骤 2 次数越多，离心 10 s.标签这些"绑定 2 和 3"。
6. 任何颜色的变化或对分数的观察记录。血红蛋白是彩色的蛋白，看起来红棕色，而细胞色素 C 是略带红色的颜色。

3.结果: 阳离子交换的血红蛋白和细胞色素 C

1. 细胞色素 C 有 10.5 和血红蛋白 6.8 pI pI。因此，当使用时 ph 值 8.1 平衡缓冲液，血红蛋白不绑定到列因为它带负电荷的离子。细胞色素 C 在此 ph 值带正电，并绑定到列，因为 ph 值 < pI。
2. 血红蛋白是未绑定的馏分中观察到，因为它不绑定到列。
3. 细胞色素 C 被观察在绑定的分数，因为它被绑定到阳离子交换柱。

图 1。非结合型的分数 （血红蛋白） 和绑定的分数 （细胞色素 C） 的图片。