抗体生成:使用杂交瘤生产单克隆抗体

Overview

资料来源:弗朗西斯·萨亚斯塔德^1，2，惠特尼·斯旺森^2，3和托马斯·格里菲斯^{1，2，3，4}
¹明尼苏达大学明尼阿波利斯分校微生物学、免疫学和癌症生物学研究生课程，MN 55455
²明尼苏达大学明尼阿波利斯分校免疫学中心，MN 55455
³明尼苏达大学泌尿科，明尼阿波利斯，MN 55455
⁴共济会癌症中心，明尼苏达大学明尼阿波利斯分校，MN 55455

多边克隆抗体被定义为针对抗原或多种抗原的不同抗原决定子（1）的抗体的集合。虽然多克隆抗体是识别生物分子的有力工具，但有一个重要的局限性 - 它们无法区分具有抗原决定因素的抗原。例如，当牛血清白蛋白用于给动物接种疫苗时，具有不同表面Ig的B细胞对牛血清白蛋白上不同的抗原决定因素有反应。结果是抗血清中的抗体混合物。由于牛血清白蛋白与人类血清白蛋白在进化保存区域与人血清白蛋白共享一些表皮，这种抗牛血清白蛋白抗血清也会与人血清白蛋白发生反应。因此，这种抗血清对区分牛和人血清白蛋白没有用处。

为了克服多克隆抗血清的特异性问题，我们采取了几种方法。一种是通过通过固定抗原（2）的色谱柱吸收不需要的抗体。这种方法是乏味的，往往不能完全去除不需要的抗体。另一种方法是分离单个产生抗体的B细胞，并在培养中扩大它们。然而，像大多数正常未转化的细胞一样，B细胞在长期培养中无法存活。

为了克服B细胞在培养中生存的能力，一种方法是制备骨髓瘤-B细胞杂交瘤。1847年，亨利·本斯-琼斯发现多发性骨髓瘤（一种淋巴瘤）患者产生了大量抗体（3）。这些患者的B细胞已经变得恶性，并不受控制地生长。由于恶性B细胞来自单个克隆，它们相同，只产生一种类型的抗体（即单克隆抗体或mAb）。然而，这些骨髓瘤细胞大多产生未知特异性的抗体。1975年，塞萨尔·米尔斯坦和乔治·科勒通过将骨髓瘤细胞融合到B细胞中，成功地培育出一种可以在体外无限期培养的杂交瘤，并产生无限数量的已知抗原特异性的单克隆抗体（4）。其方法背后的原理是结合骨髓瘤细胞的不朽特性和产生B细胞的抗体特性。其技术彻底改变了抗体生产，为使用单克隆抗体识别和纯化生物分子提供了强有力的手段。

一般来说，制备单克隆抗体需要几个月。一般过程包括以下步骤:

抗体皮毒的免疫和筛选
产生抗体的B细胞和骨髓瘤细胞的融合
杂交瘤的选择性生长
筛选杂交瘤以产生所需的单克隆抗体
通过限制稀释进行克隆 - 将细胞稀释到浓度以统计上允许向 96 孔板的孔中添加少于 1 个细胞的过程。有些井最终将有0个细胞，有些将有1个细胞。种子有1个细胞的井最终将长成单克隆细胞群。
杂交瘤的生长与单克隆抗体的制备

该协议侧重于最后一步 - 杂交瘤的生长和单克隆抗体的制备。抗体通过硫酸铵沉淀（通常称为盐化）从培养上清液中纯化 - 一种常用的方法，从溶液中去除蛋白质。溶液中的蛋白质与其他亲水性相互作用一起通过暴露的极性组和离子组与水形成氢键。当加入小、高电荷离子（如铵或硫酸盐）的浓度时，这些组与蛋白质竞争与水结合。这从蛋白质中去除水分子，降低其溶解度，导致蛋白质沉淀。

Procedure

注意:在以无菌方式处理混合瘤细胞和介质时（例如，在生物安全柜中），在抗体净化步骤之前，应保持无菌细胞培养技术。

1. 解冻冷冻杂交细胞

在37°C水浴中孵育含有冷冻杂交瘤细胞的瓶，直到刚解冻（约2分钟）。
将解冻细胞加入含有10 mL完整RPMI（RPMI补充10%胎儿牛血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、1mM丙酸钠、1x非必需氨基酸、50μM 2-Mercaptoto酸、10mM HEPES）的15mL锥形管中。
在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以洗掉任何污染冷冻介质。
离心后，丢弃液体上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 mL新鲜完整的RPMI中。然后，将细胞添加到含有15 mL完整RPMI（RPMI最终体积为20 mL）的T75组织培养瓶中。
在37°C的标准培养箱中生长_细胞，CO2为5%。在培养中，细胞是非粘附的。

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Results

使用该协议，我们获得了以下结果与几个不同的杂交瘤:

杂交瘤: RB6-BC5 （大鼠抗小鼠 Ly6C/Ly6G （Gr1） IgG2b， +mAb）
OD₂₈₀ - 1.103
(1.103/1.43)（20） = 15.42毫克/升

杂交瘤: GK1.5 （大鼠抗小鼠 CD4 IgG2b， β mAb）
OD₂₈₀ - 0.485
(0.485/1.43)（20） = 6.78毫克/升

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Application and Summary

上述程序是一种简单、直截了当的方法，用于从杂交瘤培养上清液中纯化单克隆抗体。重要的是要记住，虽然，硫酸铵将沉淀其他蛋白质，可能是在培养上清。因此，从吸光度测量中确定的抗体浓度是估计值。用户可能希望通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行少量，来评估透析样品的纯度。杂交瘤产生的mAb，一旦使用这种方法进行纯化，就可以以多种方式使用。上述RB6-BC5、GK1.5和2.43 mAb通常用于小鼠?...

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References

Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

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注意:在以无菌方式处理混合瘤细胞和介质时（例如，在生物安全柜中），在抗体净化步骤之前，应保持无菌细胞培养技术。

1. 解冻冷冻杂交细胞

在37°C水浴中孵育含有冷冻杂交瘤细胞的瓶，直到刚解冻（约2分钟）。
将解冻细胞加入含有10 mL完整RPMI（RPMI补充10%胎儿牛血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、1mM丙酸钠、1x非必需氨基酸、50μM 2-Mercaptoto酸、10mM HEPES）的15mL锥形管中。
在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以洗掉任何污染冷冻介质。
离心后，丢弃液体上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 mL新鲜完整的RPMI中。然后，将细胞添加到含有15 mL完整RPMI（RPMI最终体积为20 mL）的T75组织培养瓶中。
在37°C的标准培养箱中生长_细胞，CO2为5%。在培养中，细胞是非粘附的。

2. 杂交瘤扩张

让细胞膨胀约3天，直到烧瓶是+80%的汇入。
注意:此时间量可能因细胞的起始数量以及不同细胞的生长速率的固有差异而异。细胞处于指数生长阶段非常重要。
一旦初始烧瓶达到+80%的汇合，从初始T75烧瓶中取出细胞，放入圆锥形离心管中，旋转（1200 RPM，5分钟）以颗粒细胞。
将细胞悬浮在6 mL的完整RPMI中，然后将细胞悬浮液分配到三个新的T75瓶（2 mL/烧瓶，含有18 mL RPMI）。在 37°C 下用 5% CO₂孵育这三个 T75 烧瓶，直到它们发生 ±80% 的汇合（这大约需要 3 天）。

3. 无血清介质中的抗体生产

注意:此时，细胞准备在专为杂交瘤细胞系生长而设计的无血清培养基中继续生长。在此协议中，我们使用含有 HB101 补充剂产品的即用型、商用 HB 基础液体介质。

三个 T75 烧瓶中的每个细胞（在 ±80% 汇合时）被收集并离心（1200 RPM，5 分钟）。
每个T75瓶中的细胞颗粒被重新悬浮在10 mL补充的HB101无血清培养基中，然后加入两个T225烧瓶补充HB101无血清介质（即5 mL细胞悬浮液，每个瓶中每个瓶中含有+220-240 mL HB101）。
在 37°C 的 T225 烧瓶和 HB101 介质中继续生长，在 5% CO₂下生长三周，或直到细胞开始死亡。细胞在这3周内产生mAb，并将其分泌到培养基中。一旦细胞开始死亡，它们就不再产生任何mAb。

4. 抗体纯化 - 第1天

注意:此时，不需要保持无菌，因此无需以无菌方式处理介质（例如，在生物安全柜中）。此外，杂交瘤不被视为"BSL2级"代理。

将烧瓶中的介质倒入管中，用于固定角度转子。在10，000RPM的固定角度转子的离心机中旋转管子8分钟。此步骤旨在从培养液上清液中清除细胞碎片。
注意:管尺寸可能因使用的转子而异。要记住的重要的事情是，在管中具有相同的体积，以确保转子在离心前得到适当的平衡。介质的整个体积可能一次无法放入离心机中。其余介质稍后将使用相同的管离心（步骤 4.5）。
在被冰包围的桶中，用搅拌棒准备一个 2L 塑料烧杯。放在搅拌盘上。
在 1L 瓶上安装 500 mL 的过滤器顶部。通过适当的管道将瓶顶过滤单元连接到室内真空。
将步骤 4.1 中的上清液（仍包含杂交细胞产生的 mAb）倒入过滤器顶部。
继续使用同一组管从介质中颗粒细胞碎片（颗粒将继续生成）。等待运行真空，直到过滤器顶部已满，另一批上清液准备倒入。不要让过滤器变干或过滤会变得很慢。
当 1L 瓶接近满时，取出滤芯顶部并将上清液倒入步骤 4.2 中准备的 2L 烧杯中。重新连接过滤器顶部。跟踪卷。
重复离心和过滤步骤，直到处理所有介质。
每收集1L过滤上清液，可测量出295克硫酸铵。搅拌时，在接下来的几个小时内（每15分钟约25克）缓慢地将硫酸铵加入上清液中，以防止硫酸铵盐的局部高浓度，可能导致不需要的蛋白质沉淀。
加入所有硫酸铵后，用铝箔盖住烧杯，用搅拌板移动到 4°C（例如，步入式冰箱或冷藏室）。搅拌过夜。溶液的不断搅拌需要使盐溶解，但长时间的搅拌会导致溶液中蛋白质在表面/空气界面上的变性。
使用固定角度转子清洗管。

5. 抗体纯化 - 第2天

将含有上清液的硫酸铵从 2L 烧杯倒入管中，用于固定角度转子。在离心机中旋转，在6500RPM下固定角度转子，无需制动，旋转20分钟。
真空吸出上清液，注意不要吸起颗粒，因为它将是软的。继续使用同一组管子从含有上清液的硫酸铵中收集颗粒。
在最后一次吸入后，将每个颗粒（含有抗体）重新悬浮在+1 ml PBS中。
通过对大量PBS的透析，从沉淀的mAb溶液中去除硫酸铵。为此，首先为 mAb 溶液的每个 mL 切割大约 1 英寸的透析管（例如，Membra-Cel MD25-14 MWCO 12，000-14，000 道尔顿切断纤维素透析管）。用 dH₂O 将管子与管子的一端打结，然后用 dH₂O 填充，以检查该结是否泄漏。从管中清空 dH₂O。
移液器 PBS/抗体溶液进入管材。用额外的 0.25 ml PBS 冲洗管，然后转移到管中。
使用橙色透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。
将油管顶部贴在 4L 烧杯的外顶部。让油管的填充部分悬挂到烧杯中。用 PBS 填充烧杯，并添加搅拌棒。
在4°C下搅拌8小时。
用新鲜的 PBS 更换烧杯中的 PBS，再搅拌 8 小时。
将抗体从管转移到15或50毫升锥形管。在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以清除可能形成的任何沉淀物。将上清液转移到新鲜的管子上。
用PBS（5μl抗体+ 95μlPBS）稀释抗体的等分1:20。用分光光度计（带PBS的空头）在280nm处定量抗体浓度。使用消光系数（+） 1.43。浓度计算为
将抗体与螺钉盖小瓶进行比对，并储存在 -80°C。

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