Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

打开激光扫描共聚焦显微镜并将载玻片放在载玻片支架上。对于图像可视化和采集，请选择20X物镜。从共聚焦软件中，选择顺序扫描模式以避免 BODIPY 493/503 和 DAPI 之间的串扰。

然后使用 488 纳米氩激光线激发 BODIPY 493/503 模具，使用 405 纳米激光线激发 DAPI 染色。将 BODIPY 的发射范围设置为 493 至 589 纳米，将 DAPI 的发射范围设置为 410 至 464 纳米。接下来，通过调整帧尺寸、扫描速度和平均值来配置显微镜设置，其中包括数字两倍位深度为 12 位、方向为双向、扫描区域数字变焦减 1 和针孔减去一个区域单位。

调整增益和数字增益设置。确保没有范围指示器指示的饱和像素。准确识别脂滴后，使用BODIPY和DAPI通道获取图像。

要创建广域图像，请切换到 10 倍主观镜头。然后激活平铺扫描模式并将其配置为生成五乘五的马赛克图像。要生成 3D 和正交视图，请在盖玻片顶部涂抹一滴浸油，然后将物镜更换为 40X 镜头。

选择 Z 堆栈模式。调整 Z 平面以定义图像捕获的第一个和最后一个位置，确保光学切片厚度约为 0.5 微米，以捕获聚焦的所有液滴。选择正交模块并创建正交视图。

通过按照透明渲染模式选择3D模块来获取3D图像。图像采集后，开始使用CellProfiler处理和分析单平面图像。通过单击CellProfiler界面左上角的图像模式，以TIF格式上传图像。

使用名称和类型模块根据文件名在 BODIPY 液滴和 DAPI 细胞核染色图像之间进行排序。对于脂滴分析，仅使用BODIPY染色图像。通过单击调整模块启动管道构建，并选择颜色为灰度模块以将图像转换为灰度。

然后使用识别主要对象模块，定义6至300像素之间的脂质液滴和1的阈值校正因子，以检测灰度图像内的脂滴。要测量已识别的脂滴的像素强度，请添加测量对象强度模块。结合一个额外的过滤器对象模块，以确保只有最强的信号被量化，而强度较低的信号被排除在最终的脂滴分析之外。

接下来，要测量与输出数据相关的脂滴，请添加测量对象大小形状模块。然后添加一个叠加轮廓模块，将识别出的液滴叠加在原始图像上，从而确保分割在未处理的图像上看起来也很准确。完成后，添加导出到电子表格模块，然后单击左下角的分析图像按钮。

与对照组相比，HFD喂养的动物表现出明显的血脂异常特征和循环甘油三酯水平的微妙增加。广域图像显示HFD喂养动物肝脏中的脂滴增加。使用CellProfiler分析显示，肝脂液滴数量增加，BODIPY荧光强度增强，面积比360%和直径更大。

HFD喂养动物的尺寸分布显示，大于9微米的大囊泡肝脂滴增加，小于3微米的微囊泡减少。