打开荧光测量的所有采集设置组件。将含有解离肌纤维的35毫米玻璃底培养皿放在显微镜载物台上。用1， 000微升移液管小心地除去培养基，并用2毫升室温铃声溶液代替。
使用机械或电动机械手，将两根铂丝垂直于培养皿底部放置。确保电极端子相对于光纤的纵轴对齐，并且距离光纤末端几毫米。如果安装在独立的微型机械手上，则通过旋转培养皿或移动每个电极来调整电极位置。
打开透射光，使用20倍物镜找到视野中的光纤。将 EGFP 滤镜立方体移动到光通道中。关闭透射光后，使用遥控快门激活488纳米激发光。
要识别 EGFP 正光纤，请将具有最亮 EGFP 信号的光纤居中在视场中间。使用位于激发光路中的光圈将激发光聚焦在光纤的特定区域。这样可以实现信号采集，其中EGFP CaV1.1信号最大。
用机械载物台调整光纤位置以与光圈光路对齐，并存储光纤XY位置。返回到第一个保存的定位后，将两个连续刺激脉冲的持续时间设置为 1 毫秒，将振幅设置为 20 伏，并将脉冲的极性设置为交替。然后，使用手动触发开关传递两个连续脉冲。
在刺激期间，观察两个同心均匀的纤维收缩，以响应两个相反极性的脉冲。如果交替极性脉冲没有观察到收缩或只有一个同心收缩，则从实验的其余部分丢弃光纤。将 2 微升 10 毫摩尔 MTS 5 TAMRA 溶液直接加入培养皿中，并用 1， 000 微升移液管轻轻混合。
孵育四到五分钟，使荧光硫醇分子扩散到横向小管系统腔中。通过场刺激，应用双极重复刺激，以 50 赫兹的速率唤起连续动作电位列车，每 1 秒 300 毫秒，持续 5 分钟。用1， 000微升移液管从培养皿中取出染色溶液。
并用2毫升室温铃声溶液代替。让染色的纤维从染色方案中恢复至少 10 分钟。用两个交替脉冲重新评估光纤健康和电活动后，将MTS 5 TAMRA滤光片立方体移动到光路中，并使用遥控快门激活533纳米激发光，以目视确认纤维上的染色。
接下来，使用电动载物台上存储的位置，使用MTS 5 TAMRA滤芯，隔膜和60X油浸物镜将光纤放置在田的中间。在光纤两端重新定向场刺激铂丝后，将光纤主轴上的导线对齐成一条直线，并将它们间隔五毫米，光纤位于中心。在采集软件上，选择将用于采集的协议。
此步骤仅由计算机控制，并触发所有下游设备进行电刺激和光路快门控制。对于每个协议，尽可能减少总采集时间以避免信号漂白，但在第一次电刺激之前允许几十毫秒的光照明和信号采集记录基线。通过点击执行来运行协议。
记录的信号会自动显示在屏幕上。信号的小幅度和光纤的快速机械收缩往往隐藏了大部分信号，并显示出运动伪影。在记录溶液中加入1微摩尔的100毫摩尔和苯甲酰对甲苯磺酰胺，以尽量减少收缩反应，并进一步区分由于纤维激活引起的S4运动产生的信号。
几分钟后，再次运行相同的协议。运动伪影现已移除，但与S4机芯相对应的小荧光变化仍然存在。使用机械载物台稍微移动培养皿，以从没有任何纤维或碎屑的区域获取信号。
最后一次运行协议以记录背景荧光。导出迹线并使用电子表格程序将信号表示为 f 0 上的增量 f 作为时间的函数，并在需要时应用基线校正。此处显示了表达EGFP CaV1.1构建体的解剖和未解离肌肉的透射和荧光图像的示例。
图中显示了MTS 5 TAMRA染色前后表达EGFP CaV1.1 VS D3构建体的肌肉纤维的代表性图像。这种染料还可以染色非转染纤维的内源性半胱氨酸。EGFP CaV1.1 VS D3 构建体和 MTS 5 TAMRA 染色的共聚焦图像显示了 CaV1.1 定位在肌纤维横向小管系统上的双带模式特征。
此处显示了响应两个刺激并用光电二极管测量的代表性荧光记录。两个信号都通过其最小值进行归一化，并绘制为相对于其各自去极化的时间函数。这些记录表明，对于施加在光纤上的两种去极化，信号的上升相位和达到峰值的时间是相似的。
