Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

在生物安全柜内，用无菌镊子取出小鼠脂肪组织。去除多余的PBS后，将组织转移到另一个培养皿中，并用10毫升PBS AA溶液洗涤两次，每次五分钟。将20毫升制备的胶原酶溶液加入含有一平方厘米大小的碎片组织和磁棒的水晶烧杯中。

将密封的烧杯在 37 摄氏度下持续搅拌孵育。通过40目0.38毫米不锈钢孔过滤匀浆 在培养皿上过滤并将细胞悬液收集在无菌的50毫升锥形管中。小心地将基质血管部分悬浮在20毫升温热补充的DMEM中，并离心悬浮液。

弃去上清液后，用40毫升未补充的DMEM培养基轻轻洗涤细胞两次。将上颚悬浮在五毫升补充的DMEM中。将悬浮液转移到25平方厘米的T瓶中并孵育。

用五毫升温热的PBS AA洗涤细胞三次，用未补充的DMEM洗涤细胞两次。为了去除任何细胞碎片和非小鼠细胞，加入五毫升新鲜，温暖的补充DMEM，并每三到四天更换一次培养基。一旦细胞达到90%至100%汇合度，向DMEM洗涤的细胞中加入一毫升温热的胰蛋白酶EDTA溶液。

在 37 摄氏度下孵育五到七分钟。将四毫升补充的DMEM加入分离的细胞单层中，并轻轻分解悬浮液。将细胞悬浮在五毫升温暖的补充DMEM中。

离心并丢弃上清液后，将沉淀轻轻混合在一毫升补充的DMEM中。用台盼蓝染色细胞，并在Neubauer室中计数。T-75烧瓶中的种子细胞。

为确保集落形成和高增殖，请在光学显微镜下观察苏木精和伊红染色细胞的形态。苏木精和伊红染色显示广泛的细胞质，具有细长的延长和丰富的细胞内微丝。