在从5， 000名年轻成年秀丽隐杆线虫中收集染色质交联和细胞核后的第一天，将重新悬浮在450微升清水中的细胞核颗粒转移到干净的1.5毫升微量离心管中。然后加入60微升10X DPN2限制性内切酶缓冲液并充分混合。将样品与15微升10%十二烷基硫酸钠在37摄氏度下孵育一小时。
通过加入75微升20%Triton X 100并如前所述孵育来淬灭反应。从样品中分装10微升，作为未消化的对照，并将其储存在4摄氏度。将400单位DPN 2添加到样品的其余部分后，将其在37摄氏度下孵育过夜，搅拌以进行染色质消化。
在第二天，向样品中额外添加 200 个单位的 DPN 2。要完成交联样品的消化，请在37摄氏度下搅拌孵育4小时。通过在65摄氏度下孵育样品20分钟来加热限制性内切酶。
如果酶不能受热灭活，则加入80微升10%十二烷基硫酸钠并孵育。然后，向样品中加入 375 微升 20%Triton X 100 并通过旋转混合。从样品中保留 10 微升等分试样作为消化对照。
对于染色质连接，将样品转移到干净的50毫升锥形管中。用分子级水将样品体积调节至5.7毫升，并通过旋转混合。然后，加入 700 微升 10 X T4 连接酶缓冲液，然后加入 60 单位的 T4 DNA 连接酶，并将样品在 16 摄氏度下孵育过夜。
在第三天，进行蛋白质消化和反向交联。向 3C 样品中加入 30 微升每毫升 10 毫克蛋白酶 K，并在 65 摄氏度下搅拌孵育过夜。要在第四天开始纯化3C文库，向样品中加入30微升每毫升10毫克RNase A并通过旋转混合。
孵育后，向样品中加入七毫升苯基氯仿，摇匀混合。将样品在3， 270 G和室温下离心15分钟。收集水相并将其转移到干净的50毫升锥形管中。
加入等体积的氯仿，摇匀混合样品。如图所示再次离心样品后，将水相转移到另一个干净的50毫升锥形管中。加入7.5毫升分子级水，35毫升100%乙醇和每毫升7微升1毫克糖原。
将适当混合的样品冷冻在零下80摄氏度。当样品冻结时，通过使用分子级水将对照的体积调节到500微升来开始纯化对照样品。加入两微升每毫升10毫克的RNase A，并通过轻弹试管进行混合。
接下来，向装有对照的试管中加入一毫升苯基氯仿，并通过摇动混合。离心管。将水相转移到干净的1.5毫升微量离心管中后，加入等体积的氯仿。
如前所述，在收集水相之前进行离心。向收集的水相中，加入一毫升乙醇和每毫升糖原两微升一毫克。摇动混合样品后，在零下80摄氏度下孵育30分钟。
接下来，将样品在 3， 270 G 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。除去上清液后，加入750微升冷冻的70%乙醇并离心。将风干颗粒重新悬浮在50微升分子级水中。
如果不立即进一步进行，可以在此处冻结暂停。要继续3C样品纯化，请将样品从冰箱中取出，并以3， 270 G离心30分钟。加入10毫升冷冻的70%乙醇，分解DNA沉淀。
离心并除去上清液后，在室温下部分风干样品。通过上下移液将沉淀重新悬浮在pH 7.5的150微升10毫摩尔tris HCL中，以获得纯化的3C文库。对一个实验样品和两个对照3C样品进行的QPCR有助于生成酶解效率数据。
3C样品在测试的七个基因组位点上的消化效率约为88%。
