Quantification of Intramuscular Adipose Tissue (IMAT) Lipid Droplet Metrics Using Confocal Imaging

要开始定量染色的IMAT脂滴指标，请在ImageJ中打开共聚焦堆栈。通过选择“图像”，然后选择“调整”，然后选择“阈值”，打开“阈值”用户界面。在用户界面中，选择“Intermodes”作为阈值类型，并确保选择“深色背景”。

然后单击“应用”以运行阈值算法。运行分水岭算法，通过选择“处理”，然后选择“二进制”和“分水岭”来分离接触的脂滴。在对话框中选择“是”以处理堆栈中的所有图像，以添加一条细黑线，将较大的纯白色区域划分开来。

要设置最大和最小颗粒大小，请使用椭圆形工具打开原始图像并勾勒出视图中最小和最大的脂滴。然后，通过键入 T.Select Analyze，然后键入 Set Measurements，将这些形状添加到 ROI 管理器中。在对话框中，选择设置，选中“仅区域”，然后单击“确定”。然后从 ROI 管理器中选择度量。

使用此结果窗口中的两个面积测量值作为尺寸范围并分析颗粒。使用分析粒子算法识别感兴趣区域或 ROI。选择“分析”（Analyze），然后选择“分析粒子”（Analyze Particles）。

将打开一个对话框，用于设置选择设置。要输出 ROI 测量值，请选择“分析”，然后选择“设置测量值”，然后选择“面积”、“质心”、“拟合椭圆”和“堆叠位置”。单击“确定”。然后从 ROI 管理器中选择度量。

可以选择结果表中的数据并将其复制到 Excel 中，以便进一步分析。为了详细评估单个脂滴指标和分布，通过共聚焦显微镜对BODIPY荧光标记的脂滴进行成像。阈值和形状分割为生成每个脂滴的 ROI 提供了良好的第一次通过。

但是，需要手动编辑来纠正错误。在图像上看起来很暗的深脂滴，可以使用 ImageJ 中的椭圆形工具手动添加。一组被错误地识别为单个 ROI 的脂滴也可以通过删除原始 ROI 并将其替换为多个新的 ROI 来纠正。

在多个切片中，单个脂滴被确定为唯一的 ROI，而重复的 ROI 则被合并为单个 ROI。