首先，将HEK293A细胞接种在光泽盖玻片上，放入含有高葡萄糖DMEM的24孔板中，直到它们达到80%汇合。第二天，在厄尔的平衡盐溶液中使细胞挨饿两个小时。处理后，吸出培养基，加入500微升或4%甲醛溶液的PBS溶液，在室温下孵育20分钟以固定细胞。
固定后，用500微升PBS代替甲醛溶液。接下来，通过在室温下在 PBS 中加入 50 微升 50 毫摩尔氯化铵溶液 10 分钟来淬灭游离醛基团。用 500 微升每毫升 50 微克洋地黄皂苷溶液的 PBS 溶液替换氯化铵溶液 5 分钟以透化细胞。
透化后，用 500 μL PBS 替换洋地黄皂苷溶液，重复 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，将细胞在室温下在 500 微升封闭溶液中孵育 30 分钟。孵育后，用 500 微升 PBS 替换封闭溶液。
接下来，使用镊子，从孔中收集盖玻片，并使用薄纸巾擦除多余的PBS。在加湿室中，轻轻地将盖玻片，细胞面朝下，滴入 50 微升的一抗溶液上。将细胞在室温下在潮湿的室中孵育一小时。
孵育后，收集盖玻片并排出多余的一抗溶液。将盖玻片放回 24 孔板中，细胞面朝上，并用 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，收集盖玻片并排出多余的 PBS，然后将每个盖玻片的细胞面朝下放在 50 微升的二抗溶液滴上。
在加湿室中孵育一小时。孵育后，排出多余的二抗溶液，并在 24 孔板中用 500 微升 PBS 洗涤盖玻片 3 次。排出过量的 PBS 后，将每个细胞面朝下的盖玻片放在 50 微升的钩子溶液上，在加湿室中用 PBS 稀释 1 至 4， 000。
在加湿室中孵育五分钟。接下来，除去多余的钩子溶液，并在24孔板中用PBS洗涤盖玻片三次，用去离子水洗涤一次。排出多余的去离子水后，将每个盖玻片放在显微镜载玻片上斑点的 10 至 20 微升封固液滴上，以避免形成气泡。
