Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

首先将组织放入无菌组织培养板中并除去多余的培养基。用无菌金属尺测量组织并拍照。向切割的纸巾中加入 3 毫升高级 DMEM/F-12 培养基，然后上下吸取纸巾进行清洗。

然后用三毫升PBS清洗组织。从组织培养板中吸出培养基，并使用无菌刀片和两毫升消化培养基将其切成小块。然后将组织收集到一个 50 毫升的管中，该管总共含有 5 毫升的消化培养基。

将试管在 37 摄氏度下孵育一小时。通过上下移液定期混合悬浮液。通过向试管中加入 5 毫升高级 DMEM/F-12 来灭活胰蛋白酶。

然后通过 70 微米的孔隙过滤器过滤样品以去除任何大碎屑。现在将两毫升含有 10% FBS 的 DMEM 移液到过滤器顶部，并使用移液器收集碎片和组织残留物进行成纤维细胞培养。然后铺板碎屑进行成纤维细胞培养。

将滤液在室温下以 200 至 300 g 离心 5 分钟，然后吸出上清液。向沉淀中加入 5 毫升高级 DMF 12，并再次以 300 G 离心悬浮液 5 分钟。对于红细胞裂解，将沉淀重悬于四毫升氯化铵钾裂解缓冲液中，并将其转移到 15 毫升试管中。

将细胞在室温下孵育两分钟。在与前面所示的相同条件下离心混合物后，吸出上清液。向沉淀中加入 5 毫升先进的 DMEM/F-12，并在 4 摄氏度下再次离心。

吸出上清液后，向沉淀中加入一毫升市售细胞解离试剂，并在室温下孵育两至三分钟。孵育后，离心并再次吸出上清液。然后将沉淀重悬于 5 毫升高级 DMEM/F-12 中。

通过使用P1000移液管多次移液悬浮液来解离细胞团块。离心悬浮液并除去上清液。接下来，获取预冷的P1000和P200移液器吸头，并使用固定在P1000移液器上的冷吸头将细胞沉淀重悬于膜基质中，然后将Falcon放在冰上以防止凝固。

从培养箱中取出预热的板。使用设置为48微升的P200移液器并使用冷吸头，在预热板中形成基底膜基质圆顶。然后将其孵育以固化基底膜混合物。

基质固化后，加入 2 至 2 毫升半的高级 DMEM/F-12，并补充生长因子和抑制剂。在 15 天内从新鲜组织中分离肿瘤细胞并建立肿瘤类器官。有时，大体积的细胞碎片会妨碍对发展中的肿瘤类器官的准确可视化。

观察到发育中的类器官在表型上从分离的、圆形的培养物到球状或聚集体培养物不等，具体取决于肿瘤起源。类器官培养物可能被成纤维细胞污染，成纤维细胞是原发肿瘤细胞培养的常见 PI 产物。培养约 7 天后，成纤维细胞从基底膜基质穹顶迁移并粘附在细胞板上，这可能会影响最佳类器官生长。

成纤维细胞培养物是从过滤器中回收的组织碎片中建立的。细胞从组织碎片中迁移出来并粘附在培养板上。