Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

在融合蛋白的氨基末端克隆囊泡成核肽或VNP序列标签后，从37摄氏度的新鲜细菌转化到饱和培养5毫升溶原肉汤或LB起始剂。然后，用它来接种 25 毫升极好的肉汤或 TB，在 500 毫升的锥形烧瓶中含有适当的抗生素选择。将烧瓶在37摄氏度的培养箱中孵育，同时以每分钟200转或大于等于25毫米轨道抛动的速度振荡，直到培养物达到600纳米光密度值或OD 600，为0.8至1.0。

然后，通过将IPTG添加到高达20微克/毫升或84微摩尔的终浓度来诱导T7启动子的重组蛋白表达。在留出足够的诱导时间后，通过在3000G下在4摄氏度下离心20分钟来沉淀细胞。将上清液通过无菌和不含洗涤剂的0.45微米PES过滤器，对含有囊泡的培养基进行灭菌以进行长期储存。

要将囊泡浓缩成较小的体积，请将含有无菌囊泡的培养基通过无菌且不含洗涤剂的0.1微米MCE过滤器。然后，用0.5至1毫升无菌磷酸盐缓冲盐水或PBS轻轻清洗膜，并使用细胞刮刀或塑料撒布器小心地从膜上去除囊泡。使用移液管将囊泡浓缩物转移到新鲜的微量离心管中。

纯化的囊泡可以在四摄氏度下储存。使用适当的时间表对无菌培养基中含有囊泡的蛋白质进行超声处理，以破坏囊泡脂质膜并释放蛋白质。将超声处理的悬浮液在39， 000 G和4摄氏度下离心20分钟以去除囊泡碎片。

BL21DE3含有VNp6-mNeongreen表达构建体的大肠杆菌显示，用IPTG诱导了过夜的mNeongreen荧光。通过离心去除细菌细胞后，荧光在培养物中仍然可见。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，在清除的培养基中的培养物中存在VNp-mNeongreen。

PBS中重悬的纯化囊泡也显示出荧光。