通过将蜜蜂与两微升带 6xHis 标签的重组烟草蚀刻病毒或 TEV 蛋白酶孵育,从用于纯化染色质单拷贝基因位点的磁珠中释放 lexA CBP 染色质环复合物。使用磁架转移将蜜蜂与最终洗脱液分离后,含有裂解染色质的洗脱液环入新的 1.5 毫升反应管中。同样,将试管放在磁架上,以将残留的珠子与最终洗脱液分离。
将珠子重悬于 750 微升冷碳酸铵缓冲液中,然后将一些样品储存在 20 摄氏度下进行 DNA 和蛋白质分析。从最终洗脱液中取出样品并将其储存在 20 摄氏度下用于 DNA 和蛋白质分析。此外,从残留的珠子中取样。
通过在 750 微升冷碳酸铵缓冲液中洗涤磁珠两次开始变性洗脱,每次 20 分钟,以 4 摄氏度的速度以每分钟 20 转的速度旋转。接下来,向珠子中加入 500 微升 0.5 摩尔氢氧化铵以提取结合的 lexA 染色质复合物并在室温下孵育 30 分钟。使用磁架将珠子从悬浮液中分离出来,并将洗脱液转移到低结合反应管中。
将低结合反应管在室温下孵育 30 分钟,并使用磁架将珠子与悬浮液分离。完成后,将洗脱液转移到低结合反应管中。将珠子重悬于750微升去离子水中,并收集样品进行DNA和蛋白质分析。
最后,从最终洗脱液中获取DNA和蛋白质分析样品。在这项研究中,对ARS316位点和重组菌株的纯化效率进行了定量,并与对照位点PDC1进行了比较。与 PDC1 相比,ARS316 位点在流经中的回收率较低。
尽管由于 TEV 蛋白酶切割不完全,一部分染色质环仍与 TEV 微珠结合,但变性洗脱导致 80% 至 90% 的 ARS316 位点回收。这与考虑酵母基因组大小时,TEV 珠子和变性洗脱馏分中 ARS316 分子的高富集率与在任何定量馏分中均未富集 ARS316 位点的对照菌株相比。TEV 洗脱后,由于 TEV 切割效率不是 100%,因此微珠显示出更高的 ARS316 位点回收率,这导致一部分染色质环仍然与微珠结合。
然而,变性逃逸显示,当考虑酵母基因组的大小时,ARS316 位点和重组菌株的回收率为 80% 至 90%,对应于 ARS316 分子的高富集。