首先在实验前准备所有试剂，并在冰上解冻基底膜基质。然后制备小鼠单层培养基。用冷鼠单层培养基将解冻的基底膜一至20稀释，并将其保存在冰上。
使用无菌镊子将0.4微米透明细胞培养物插入24孔组织培养板的单孔中。抓住插入物的角爪并将其转移到孔中。重复上述步骤，直到有适当数量的细胞培养插入物可用于培养。
为了用稀释的基底膜基质覆盖每个细胞培养插入物的顶端表面，将P 200移液器的尖端放在插入物的中心并排出150微升基质。然后，将板转移到含有5%二氧化碳的无菌37度培养箱中至少一小时。在孵育结束时，以45度角旋转24孔板。
将一根手指放在插脚的角落以稳定刀片。将P 200移液器吸头沿插入物的底部轻轻放置，然后取出基底基质。通过用150微升不含钙或镁离子的无菌DPBS洗涤每个细胞培养插入物来去除任何多余的残留物，并让它们在生物安全柜中干燥至少10分钟。
插入物干燥后，在底部加入400微升小鼠单层培养基，在细胞培养插入物顶部加入75微升。重复直到所有细胞培养插入物浸入。将板留在生物安全柜或培养箱中，直到需要为止。
然后从培养箱中取出成熟肠结肠样的24孔板，并将其置于生物安全柜下。使用无菌吸头吸出培养基，并在室温下用一毫升无菌DPBS洗涤每个孔。使用无菌吸头去除不含钙或镁离子的DPBS。
通过在要传代的每孔中加入500微升酶解离试剂来消化基底膜基质的每个塞子。要打破塞子，请以 45 度角旋转 24 孔板。将移液器的尖端放在塞子的边缘，并通过移液每个塞子大约 6 到 10 次来轻轻将其移开。
将 24 孔板放回 37 度的无菌培养箱中，含 5% 二氧化碳，放置三到四分钟。孵育后，在生物安全柜下为每孔上下移液胰蛋白酶五到七次。将每个孔中解离的结肠样转移到无菌的15毫升锥形管中，并用冰冷的小鼠洗涤介质将体积降至10毫升。
接下来，在水平桶离心机中以 300 G 在 4 摄氏度下将部分消化的结肠样物离心五分钟。在生物安全柜下，使用10毫升移液管从沉淀中除去上清液。此外，使用 P 200 移液器去除任何剩余的培养基。
然后，通过加入75微升小鼠单层培养基重新悬浮结肠样沉淀。将75微升结肠悬浮液分配到每个细胞培养插入物的中心。轻轻移液一次或两次，然后将其添加到孔中，以确保均匀的铺板。
将带有细胞培养插入物的24孔板放在旋转平台上10分钟，以使均匀分散在细胞培养插入物上，然后将板放入5%二氧化碳培养箱中的无菌37摄氏度中。在孵育结束时，通过将吸头放在细胞培养物内部并用P 200移液管移液培养基三到五次来去除未附着的结肠碎片。避免破坏附着的肠道细胞。
立即取出培养基和结肠样混合物。重复上述步骤，直到清洁完所有细胞培养插入物。现在将150微升预热的小鼠单层培养基添加到每个细胞培养插页的顶端侧。
向新的24孔板的每个孔中加入400微升加热的小鼠单层培养基。使用无菌镊子抓住细胞培养插入物的插脚，将细胞培养插入物转移到新板上。每隔一天更换培养基，直到达到所需的汇合度。
接种在细胞培养插入物上的酶破坏结肠最初出现在15至150个细胞的细胞簇中。在第三天，细胞变平并慢慢覆盖细胞培养插入物，通常达到汇合。在接下来的几天里，单层继续生长并形成了可以定量测量的连续屏障。
