首先放置一只安乐死的小鼠进行眼球摘除术,使用弯曲的镊子按压眼睛周围的组织,将眼睛移出眼窝。然后抬起并取出眼睛,并将其转移到解剖托盘中的新鲜PBS中。使用超细剪刀,将视神经切得尽可能靠近眼球,然后小心地将细尖直镊子通过眼后视神经出口插入眼球。
现在,在眼睛后部插入剪刀,开始从后部向角膜巩膜交界处切开一个切口,并继续切口,直到交界处的一半分离。轻轻推动角膜,使晶状体可以通过切口排出。使用细尖直镊子,小心地从镜片上去除任何大块组织。
找到赤道区域后,浅浅刺穿晶状体,然后取出晶状体囊。将晶状体纤维细胞转移到装有 1% 多聚甲醛的 60 毫米培养皿中。使用锋利的手术刀,沿其前后轴将纤维细胞球分成两半。
然后沿同一轴进一步切成两半,产生四分之一。使用直镊子从晶状体纤维细胞区去除细胞核区域。接下来,将 200 微升 1% 多聚甲醛加入 48 孔板中。
将晶状体皮质转移到板上,在室温下孵育 15 分钟,并以 300 RPM 轻轻摇动。封闭后,将适当的一抗添加到 48 孔板中,并将样品转移到一抗溶液中。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜,轻轻摇晃或突变。
第二天,用PTX洗涤样品,同样,用二抗孵育它们。清洗样品后,将一滴或 50 微升封固剂加入加电显微镜载玻片上。将组织放入封固剂中。
并使用镊子轻轻地将纤维细胞彼此分开。然后,轻轻地将盖玻片放在分离的细胞和封固剂的顶部。去除多余的介质后,在共聚焦显微镜检查之前,用指甲油密封载玻片上盖玻片的边缘。
晶状体解剖和晶状体囊取出后,将纤维细胞团转移到湿手套的指尖,并轻轻地向各个方向滚动以分离晶状体核。然后,将晶状体核转移到 48 孔板中新制备的 1% 多聚甲醛溶液中,并在 4 摄氏度下轻轻摇晃或突变孵育过夜。第二天,将样品转移到装有 1% 多聚甲醛的 60 毫米培养皿中,并使用锋利的手术刀沿前后轴将晶状体核分成两半,然后分成四分之一。
然后,如前所述,对样品进行后缀、封闭、染色和封片 在这些制剂中,从不同的晶状体区域发现了具有独特形态的晶状体纤维细胞束。F-肌动蛋白网络的染色显示分化和成熟纤维中细胞膜的富集,而 F-肌动蛋白信号存在于核纤维的细胞质中。分化纤维细胞的扫描电子显微镜和共聚焦图像显示球窝交叉,具有小的互锁突起,而成熟纤维的桨叶由小突起装饰。
核晶状体纤维细胞的扫描电子显微镜和共聚焦显微镜图像显示,细胞短侧的细胞膜粗糙,并且从晶状体中心在这些细胞中具有榫槽交叉。