Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

通过用装满1.4毫米陶瓷珠的约200微升管填充2毫升PCR管来准备两个陶瓷珠管，并在将它们转移到无菌罩内之前相应地标记管。将RNA提取试剂盒中提供的推荐体积的裂解缓冲液加入标记的PCR管中。使用木制涂抹器从确认患有狂犬病感染的大脑样本中取出约三毫米的立方体，并将其放入带有样品ID的标记管中，并将100微升无核酸酶水放入标记阴性对照的管中。

使用木制涂抹棒手动破坏脑组织，然后以最大速度涡旋，直到实现完全的组织均质化。接下来，离心均质裂解物。使用移液管将上清液转移到新标记的微量离心管中，并将其用于进一步的RNA提取步骤，CDNA制备和PCR扩增。

使用引物池A和B进行CDNA制备和PCR扩增后，在PCR后区域进行PCR纯化和定量。将SPRI微珠从主瓶分装到微量离心管中。这些也可以提前准备。

将试管存放在 4 摄氏度下或将它们放在冷架或冰块中。接下来，将 SPRI 微珠等分试样加热约 20 摄氏度，并彻底涡旋以将微珠重新悬浮在整个溶液中。然后在 1.5 毫升试管中，将每个样品的引物池 A 和引物池 B PCR 产物混合。

如果需要，加水使体积达到 25 微升，然后向每种组合产品中加入 25 微升 SPRI 珠并混合。将混合物在室温下孵育 10 分钟，偶尔倒置或轻弹试管。接下来，将试管放在磁架上，直到珠子和溶液分离。

完成后，丢弃上清液而不干扰珠子沉淀。然后使用新鲜制备的 200 微升 80% 乙醇进行两次 30 秒的洗涤，然后丢弃乙醇。第二次洗涤后，使用10微升移液器吸头除去所有痕量乙醇。

风干沉淀，直到痕量乙醇蒸发，沉淀从有光泽变为哑光。将珠子重悬于 15 微升无核酸酶的水中，以回收清洁的 DNA 产物，并在室温下孵育 10 分钟。在磁架上将珠子与溶液分离。

将上清液转移到新鲜的 1.5 毫升管中后，在无核酸酶水中制备每个样品的 1 至 10 稀释液。按照制造商的说明，使用高灵敏度和特异性荧光计测量每个稀释样品的 DNA 浓度。