首先，通过打开高分辨率呼吸计来准备设备，并将其连接到呼吸测量软件VatLab进行数据采集和分析。用双蒸水代替氧合仪室中的70%乙醇。使用磁力搅拌棒，在腔室中以 750 RPM 的速度连续搅拌。
让它静置 10 分钟，然后吸出水。用双蒸水清洗腔室三次，每次五分钟。要校准氧传感器，首先取出双蒸水，然后将两毫升细胞制备培养基移入腔室。
放置塞子，留下空气交换气泡。要记录氧气校准值，请调整传感器增益、极化电压和数据记录间隔等设置。然后标记实验并输入培养基。
单击布局并选择 01 校准实验 GR3 温度。 用搅拌棒在 750 RPM 下在 37 摄氏度下搅拌介质至少 30 分钟，并监测传感器膜的性能。按住鼠标左键和Shift键，拖动鼠标选择氧气浓度变化稳定的区域。
然后点击oxygraph，然后点击O2校准。在空气校准中，将所选标记更改为之前选择的区域。然后单击校准并复制到剪贴板。
停止录制并通过单击 oxygraph 进行保存。其次是 OK Control，然后保存并断开连接。接下来，要进行呼吸评估，请打开腔室并吸出里面的培养基。
将精子细胞加载到最终体积为 2 毫升的 MRM 中，用于透化细胞分析。双击底角的 POS calib 框并打开之前执行的校准来加载校准。然后停止实验。
注射 4.5 微升 10 毫摩尔洋地黄皂苷并透化细胞 5 分钟。记录完整细胞的呼吸至少五分钟，直到获得稳定的信号。然后加入复合物I或复合物II.测量耗氧量，直到信号增加并稳定下来。
接下来，注射 5 微升 0.5 摩尔 ADP 并测量耗氧量，直到信号增加并稳定下来。每毫升添加一微升 4 毫克寡霉素，这是一种 ATP 合成酶抑制剂。测量耗氧量，直到信号减弱并稳定下来。
通过连续添加 1 μL FCCP 滴定，从 0.1 毫摩尔开始滴定至 1 毫摩尔，直到达到最大非偶联呼吸速率。测量耗氧量，直到信号增加并稳定下来。当耗氧量开始减少时停止注射药物。
最后，注射 1 μL 1 毫摩尔鱼藤酮用于复合物 I，或注射 5 毫摩尔抗霉素 A 用于复合物 II，以区分线粒体和残余耗氧量。测量耗氧量，直到信号减弱并稳定下来。要进行数据分析，请选择在注射底物或抑制剂后单位体积相关氧通量稳定的区域，单击标记，然后单击统计窗口，然后导出数据。
对每100万个精子细胞获得的数据进行归一化，并从所有值中减去非线粒体耗氧量。使用这些公式计算指数。成功记录了来自精液样本的完整精子细胞，其中蓝线表示氧气浓度，红线表示相关的每体积氧气流量。
较低的精子细胞数量导致较低的基线耗氧量。此外，使用该协议获得专门针对线粒体复合物I或复合物II的耗氧曲线。
