首先，制备 10 至 20 微克高质量总 RNA 用于分离富集 poly（A） 的 RNA。将等分试样的RNA转移到无核酸酶的1.5毫升微量离心管中。将试管在 70 摄氏度的加热块中孵育 5 分钟，然后将其放在冰上 2 分钟。
重新悬浮oligo（dT）微球后，将所需体积的微珠悬浮液转移到新的1.5毫升微量离心管中，并将其放在磁铁上三分钟，直到磁珠形成沉淀。除去上清液并加入等体积的裂解缓冲液。重悬珠子。
将试管放回磁铁上三分钟，然后取出上清液。对于第一轮纯化，将裂解缓冲液加入RNA样品管中并充分混合。然后将混合物转移到oligo（dT）微球上，并重悬完全移液至少10次。
让样品在室温下连续旋转孵育。15 分钟后，将样品放在磁铁上 5 分钟或直到上清液澄清。弃去上清液。
将 600 微升洗涤缓冲液 1 加入珠子中，小心混合以重悬。接下来，向珠子中加入 300 微升洗涤缓冲液 2，并小心混合以重悬。将试管放在磁铁上五分钟或直到上清液澄清。
弃去上清液。接下来，向样品管中加入 30 微升冷的 10 毫摩尔 tris HCL，并在 70 摄氏度下孵育。五分钟后，快速将管子转移到磁铁上。
当悬浮液澄清时，将含有洗脱的poly（A）富集RNA的上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中。对于第二轮纯化，向洗脱的RNA样品中加入120微升裂解缓冲液并充分混合。用等体积的裂解缓冲液洗涤第一轮纯化中使用的珠子。
移液 10 次以重悬珠子，然后将试管放在磁铁上 5 分钟，然后丢弃上清液。将RNA裂解缓冲液混合物转移到洗涤的珠子中，并通过移液彻底混合。如前所述洗涤珠子后，向样品管中加入 25 微升冷的 10 毫摩尔 tris HCL 并在 70 摄氏度下孵育。
五分钟后，迅速将试管转移到磁铁上，当悬浮液澄清时，将含有洗脱的poly（a）富集RNA的上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中。接下来，对于亚硫酸氢盐转化，将 19 微升纯化的富集聚 （A） 的 RNA 样品转移到 0.2 毫升八条管中，并以预定的 1 到 10， 000 的数量比加入 1 微升加标对照。在试管中加入130微升转化试剂并充分混合后，将试管放入PCR仪中，开始PCR程序。
PCR后，将色谱柱放在收集管上，并向色谱柱中加入250μL的RNA结合缓冲液。然后将 150 微升亚硫酸氢盐处理过的样品转移到色谱柱中并彻底移液。向色谱柱中加入 400 微升 95 至 100% 乙醇，快速关闭盖子并倒置数次。
反复离心，洗涤并用脱磺缓冲液中和后，将色谱柱转移到新的1.5毫升微量离心管中。向色谱柱中加入 20 至 30 微升无核酸酶的水，静置一分钟。在 25 摄氏度下以 10， 000 G 离心 30 秒，并将 2.2 微升上清液转移到 8 个条管中以评估 RNA 的数量和质量。
通过毛细管电泳总RNA测定法评估Poly（A）RNA富集效率，从而减少胰腺癌细胞系中双重纯化后的核糖体RNA污染。通过毛细管电泳评估亚硫酸氢盐处理前后的RNA量。亚硫酸氢盐处理后，由于亚硫酸氢盐反应引起的碎裂，RNA大小分布显示出200至500个核苷酸峰。
扩增子的毛细管电泳显示文库制备成功，剩余引物极少，且无过扩增峰。测序读数与参考序列对齐后，总读长数的平均值2， 440映射到加标序列，总分析的C到T转化率达到平均99.81%
