要从冻干的全息生物中提取细胞内代谢物,将 400 微升含有内标的 100% 冷甲醇加入冻干全息生物中。然后加入 10 毫克酸洗玻璃珠,将试管放入预冷珠磨机中。以 50 赫兹的速度插入三分钟。
裂解后,加入 600 微升冷甲醇并涡旋一分钟。将试管放在 4 摄氏度的烤肉架上 30 分钟。为了从分离的冻干共生细胞中提取代谢物,向干燥的共生细胞中加入200微升含有内标的冷甲醇。
然后加入酸洗玻璃珠,将试管放入预冷的珠磨机插件中,温度为 50 赫兹。三分钟后,加入 800 微升甲醇并涡旋 30 秒。为了从分离的冻干宿主组织中提取代谢物,向干燥的宿主材料中加入一毫升含有内标的冷甲醇并涡旋20秒。
然后将试管放入浮动试管支架中,在 4 摄氏度下超声处理 30 分钟。接下来进行代谢物提取物纯化,将所有样品以 3000G 在 4 摄氏度下离心 30 分钟。小心地将上清液转移到新的两毫升微量离心管中,而不会干扰沉淀。
将沉淀重新悬浮在一毫升50%冷甲醇中,剧烈涡旋一分钟。再次离心,然后收集极性提取物上清液并将其与来自同一样品的半极性提取物混合。将混合提取物以 16、100G 离心 15 分钟以除去沉淀物。
为了进行分析,将 50 微升每种提取物分装到玻璃插件中,并使用真空浓缩器在 30 摄氏度下浓缩 30 分钟。GCMS分析显示,所有处理均有107种带注释的代谢物,包括一系列氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂肪酸和无菌。K 表示聚类,识别出三个不同的样本聚类。
全息样本介于分离的宿主和共生体部分之间。尽管 K 表示簇分布,但代谢物中的平行坐标和热图可视化相对丰度表明,全息生物谱图更紧密地匹配,宿主分数图谱与宿主和共生体图谱显着不同。宿主和共生体谱彼此显著不同,有100个单独的代谢物,宿主和共生体部分之间存在显着差异。