Preparation of Yeast Cells for Imaging, Optimization of Imaging Conditions, and Image Collection

首先，取 1 毫升对数中期出芽酵母细胞培养物，表达线粒体靶向的 HyPer7。将细胞以 6， 000 G 离心 30 秒，并除去上清液，在管中留下 10 至 20 微升。使用微量移液管将细胞沉淀与残留培养基轻轻混合，重新悬浮细胞沉淀。

接下来，使用鼓风机或无绒纸巾清洁玻璃显微镜载玻片，并向载玻片中加入1.8微升细胞悬浮液。最后，用 1.5 号玻璃盖玻片盖住细胞，以一定角度缓慢降低，以避免引入气泡。然后将载玻片放在显微镜载物台上。

要对细胞进行成像，请设置采集条件以确保每个荧光通道中具有可检测的信号和可接受的分辨率。例如，在带有sCMOS相机的转盘共聚焦显微镜上，使用2x2像素合并，20%至40%激光功率和200至600毫秒曝光。接下来，检查图像直方图。

在 12 位图像中，确保像素值的总动态范围至少为几百级灰度，没有饱和。此外，请确保范围比噪音水平高一个数量级。要计算噪声水平，请测量图像无细胞区域中像素值的标准偏差。

然后收集延时图像，在采集之间没有延迟，以评估成像条件对线粒体信号稳定性和氧化应激的影响。使用显微镜采集软件或ImageJ，测量每个荧光通道中的平均像素值，以确保信号稳定性。如果实验不涉及延时成像，请确保荧光在两个或三个重复的Z-stacks上是稳定的。

以 0.5 微米的 Z 间隔采集出芽酵母的总堆叠深度为 6 微米的图像。如果收集 Z 堆栈，请确保数据集中所有图像的 Z 间隔相同，并包括整个像元。还要采集透射光图像以记录细胞边界。