Confocal Live Cell Imaging of Rat Skeletal Muscle Mitochondria

首先将大鼠骨骼肌纤维与TMRE在室温下孵育20分钟。接下来，启动共聚焦显微镜标准软件，并选择配置框架。在“硬件配置”对话框下，选择“激光”，然后选中“氦氖 543”选项。

通过“获取”框架访问“采集”对话框，然后选择“XYZ”面板。然后，选择速度为 512 赫兹的 512x400 格式。在显示的针孔面板下，选择任意单位，然后输入针孔的三个区域。

在“Bean Path”设置对话框中，选择一个 20 倍浸水物镜，其数值孔径为 0.7，发射波长窗口为 576 至 700 纳米。选择DD 488543，将543激光器的激光功率设置为15%孵育20分钟后，更换孵育介质两次。接下来，用 0.15 毫米硼硅酸盐玻璃盖玻片准备记录室。

将纤维束转移到含有 200 微升松弛溶液的腔室中。利用共聚焦显微镜的明场模式来识别用于线粒体荧光记录的活纤维。通过使用实时按钮扫描荧光来调整、增益和偏移。

对于几乎为零任意单位的背景和 100 到 200 个任意单位之间的线粒体信号，选择低荧光强度值。选择介于 150 到 190 纳米之间的像素大小，然后在 XY 对话框中调整缩放系数以获取光纤的全宽。在 Z 堆栈对话框中，设置从 15 微米光纤深度开始到 22 微米的 Z 距离，然后选择 3 微米的 Z 步长。

单击“开始”按钮获取共聚焦图像，并获取由在 15、18 和 21 微米深度采集的三个共聚焦图像组成的 Z 堆栈。锻炼瘦肌肉纤维的共聚焦图像显示了骨骼肌纤维线粒体的预期记录，具有一致的纤维模式。相比之下，肥胖的大鼠肌肉纤维在线粒体含量和分布上显示出实质性的改变。