Mitochondrial Density Analysis

首先启动图像分析软件。接下来，打开 Z 堆栈文件并调整方向以水平放置光纤。选择一个感兴趣的矩形区域或覆盖线粒体区域的 ROI。

根据光纤宽度，在 X 方向上选择 65 到 90 微米的尺寸，在 Y 方向上选择适当的尺寸。继续复制具有所选 ROI 的 Z 堆栈。并将其保存为 Tiff 格式的新 Z 堆栈。

使用 ROI 管理器工具保存原始堆栈中的 ROI 位置。使用快捷键 Command+Shift+T 打开阈值对话框。 选择 Otsu 阈值算法，然后选择黑白深色背景选项。

观察荧光强度分布的直方图和对话框中显示的阈值。将阈值应用于二进制映像堆栈，然后在显示的对话框中选择 Calculate threshold for each image （计算每个映像的阈值并创建新堆栈），然后单击 OK （确定）。以 Tiff 格式保存使用三个二进制图像生成的堆栈。接下来，访问“分析”菜单并选择“直方图”。

在弹出的“直方图”对话框中，单击“是”。在堆栈的直方图对话框中，单击列表以获取直方图数据。将直方图数据传输到电子表格，并识别值为 255 的线粒体像素。

通过将线粒体像素除以总像素并乘以 100 来计算线粒体密度。肥胖大鼠纤维的线粒体密度较低。堆栈图像分析证实了这一点。