首先，在涂有生长因子减少细胞外基质凝胶的六孔组织培养板上的IPSC维持培养基中培养hiPSC。当细胞达到 80% 至 90%v 时，从板中取出培养基并用 DPBS 洗涤细胞一次。然后加入 700 至 800 微升 0.48 毫摩尔 EDTA，并在室温下孵育一分钟。
取出消化溶液，将板在 37 摄氏度下孵育三到五分钟。当细胞被消化成片状时，加入两毫升IPSC维持培养基以终止消化。将细胞悬液转移到六孔低附着板上。
将细胞在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳和 60 RPM 孵育，以形成球形胚胎体或 EB。24小时后，使用过去的移液管，将EB转移到离心管中，并使其沉淀5至10分钟，然后再除去上清液。向试管中加入 MSC 分化培养基，并将 EB 转移到装有两毫升 MSC 分化培养基的六孔低附着刀片中。
在37摄氏度的振荡器上用5%二氧化碳培养EBs7天。在第八天，如前所述，将EB转移到离心管中。一旦EB沉淀，从试管中取出上清液。
将 MSC 维持培养基加入试管中，并将 EB 转移到含有 2 毫升 MSC 维持培养基的生长因子减少的细胞外基质凝胶包被的六孔板中。细胞粘附后，更换培养基，直到培养物达到90%汇合度。接下来，用 37 摄氏度的解离溶液处理 EB 衍生的培养物。
当部分细胞被消化成单个细胞时，加入两毫升MSC维持培养基以终止消化并将细胞悬液转移到离心管中。用DPBS从孔中洗涤剩余的未消化细胞一次。并如前所述再次消化。
然后将细胞悬液以 250g 离心 5 分钟。除去上清液并将细胞接种在明胶包被的培养板中。在MSC维持培养基中培养细胞至90%汇合度，并定期更换培养基。
如前所述，培养 hiIPC 系。当细胞达到 50% 至 60% 汇合度时，从板中取出 IPSC 维持培养基。加入两毫升MSC维持培养基。
并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 14 天，每天更换培养基。对于MSC的成熟，用37°C的解离溶液处理单层培养物。当部分细胞被消化成单细胞时，将两毫升MSC维持培养基加入孔中以终止消化并将细胞悬液转移到离心管中。
用DPBS洗涤剩余的未消化细胞一次，并如前所述消化它们。然后如前所述离心细胞悬液，并将细胞接种在明胶包被的培养皿上。在MSC维持培养基中培养细胞至90%汇合度，并定期更换培养基。
在EB形成方法中，hiIPCs菌落在分化前表现出致密的形态。解离后，形成均匀的球形EB，随着时间的推移，球形EB的体积越来越大。随后，EB转化为贴壁单层细胞，在第18天达到90%的汇合度，并在两次传代后获得纺锤形形态。
同样，在单层方法中，细胞增殖形成多层贴壁细胞。经过多次包装后，细胞成熟为具有典型纺锤体形状和漩涡状集落的MSC。流式细胞术分析显示，hiIPCs对CD90呈阳性，对CD34、CD45、CD105和CD73呈阴性。
分化后，驱动 MSC 的 hiIPC 表达 CD90、CD73 和 CD105，同时对 CD34 和 CD45 保持阴性。单层衍生的MSCs比EB方法显示出更高的钙沉积物形成。然而，在成脂和软骨分化能力方面没有观察到显着差异。
两种方法的增殖能力都保持了多达 20 次传代。
