Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC-MS/MS

首先，使用 EVtrap 方法制备从尿液样本中分离的细胞外囊泡的蛋白质组和磷酸化蛋白质组样品。通过液相色谱系统将样品注入捕获的离子淌度飞行时间质谱仪中。将肽分离到15厘米的C18柱中。

对于蛋白质组学分析，使用dia-PASEF方法获取数据，每个斜坡的质量范围为300至1200质荷比，离子迁移常数为0.6至1.50 1 1/Knot。对于磷酸化蛋白质组学分析，使用dia-PASEF采集方法采集数据。将每个斜坡的质量范围设置为 400 至 1550 质荷比，离子迁移常数为 0.6 至 1.50 1/Knot。

将原始文件加载到蛋白质组学软件中。在智人数据库中设置搜索参数。对于“消化类型”，选择“特异性”，然后在“酶”下选择“胰蛋白酶P”。

将肽长度定义为最小 7 和最大 52，并允许两次漏裂。然后将“最大变量修改数”设置为 5。固定修饰应为胱氨酸位点的脲甲基，而可变修饰应包括乙酰蛋白 N 端、蛋氨酸氧化以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。

最后，将肽谱匹配、肽和蛋白质组的错误发现率设置为 0.01。在LCMS和MS蛋白质组学分析中，每个样品的2%揭示了来自大约2,200种蛋白质的11,000多种独特肽。值得注意的是，与 ExoCarta 数据库相比，在所有三个重复中都一致地发现了 72% 的独特蛋白质，并鉴定了 90 个顶级 EV 标记和蛋白质。

定量精密度为5.7%的中低变异系数，表明具有高重现性和可靠性。对于磷酸化蛋白质组学，每个肽样品的 98% 产生了 800 个独特的磷酸肽和 350 个磷蛋白。富集得到72%的磷酸丝氨酸、22%的磷酸苏氨酸和6%的磷酸酪氨酸肽。

在所有重复中鉴定出42%的磷酸肽，观察到21.8%的中等变异系数，表明可接受的定量重现性。