Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

将表达CAR的jurkats与CFSE标记的肿瘤细胞共培养后，轻轻地将板倒置在纸巾上，轻敲以丢弃含有CAR-J的上清液。使用多通道移液器，将 100 μL 含有碘丙啶或 PI 的 FluoroBrite DMEM 培养基加入孔中，而不会干扰粘附的肿瘤细胞。然后向每种肿瘤类型的第一个孔中加入 20 微升 20%Triton X，作为完全死亡对照。

在成像前，将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 20 分钟。荧光成像后，使用细胞的仅肿瘤孔之一校准绿色荧光通道。要排除孔边缘的细胞，请将孔掩模降低到 98%在绿色荧光通道上识别 CFSE 标记的肿瘤细胞，并调整荧光强度阈值以捕获孔中的所有细胞。

将最小单元直径设置为 25 微米，以排除在 CFSE 通道中检测到的碎片。然后启用单独的触摸对象以识别单个单元格。接下来设置门来定义活细胞群和死细胞群。

选择 CFSE 标记的单元格，并在 y 轴上生成计数直方图，在 x 轴上生成平均 PI 强度的直方图。调整 x 轴值以更好地可视化细胞，并绘制拆分器以区分低 PI 染色细胞和高 PI 染色细胞。将低PI染色的细胞标记为活细胞。

接下来，在活细胞上设置另一个直方图，其面积在 x 轴上，计数在 y 轴上。将非碎片细胞标记为大活细胞。然后使用肿瘤绘制另一个分裂器，以捕获细胞并过滤掉碎片。

对整个板运行分析后，导出包含数字的电子表格。绘制大细胞的计数，以确定暴露于CAR-J后孔中剩余的活CFSE标记的肿瘤细胞的数量。最后，使用单因素方差分析进行统计分析。

CAR-J1的细胞毒性随着效应子与肿瘤比率的增加而增加，在效应子与肿瘤的比率为4：1时观察到超过50%的杀伤率。具有修饰铰链结构域的 EGFR 靶向 CAR 构建体对表达 EGFR 的 MDA-MB-231 细胞显示出抗原特异性杀伤，并且未观察到对 EGFR 敲除细胞的显着杀伤。CAR 构建体也在 PBMC 衍生的 CD3 T 细胞上表达。

然而，含CD8铰链的EGFR-CAR没有表达。与 IgG 长和 IgG 培养基相比，IgG 短路对 MDA-MB-231 细胞的细胞毒性效力最小。