用于收获中性粒细胞胞外诱捕器 （NET） 的大鼠中性粒细胞分离的一步法和两步法

要开始骨髓采集，将安乐死的大鼠浸泡在75%乙醇中，对皮毛和皮肤进行消毒。将大鼠仰卧并切断臀部的下肢以保护股骨头。使用解剖剪刀切开蹄关节处的韧带。

然后将膝关节向后折叠，露出股骨和胫骨。用镊子和剪刀小心地去除与骨骼相连的任何肌肉、肌腱和其他组织。用 5 毫米针头注射器将骨髓刺穿骨髓的两端，以松动骨髓基质。

现在使用新鲜注射器用 10-15 毫升 RPMI 培养基冲洗骨髓。在20摄氏度下以300G离心骨髓细胞10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于5-10毫升红细胞裂解缓冲液中。

孵育悬浮液后，向混合物中加入四倍体积的HBSS。然后在室温下以600G离心细胞5分钟。使用所得颗粒进行进一步使用。

首先用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离中性粒细胞。在 15 毫升离心管中加入 2 毫升 80-55% 的试剂，以形成密度梯度。然后将分离的中性粒细胞或用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离的细胞的重悬溶液移液到试管中。

在20摄氏度下以800G离心管40分钟。用无菌移液管收集70%梯度层，包括65-70%边界处的细胞层。将细胞悬液转移到新的 15 毫升离心管中。

将 15 毫升 HBSS 加入试管中，轻轻倒置以混合其内容物。最后，在室温下以300G离心管10分钟以沉淀细胞。对于一步法，将骨髓悬浮液直接移液到密度梯度管中后，如前所述进行离心。

接下来，移出 70% 梯度层，包括 75-70% 梯度边界处的层。将该细胞悬液转移到装有 10 毫升 HBSS 的新型 50 毫升离心管中。然后在室温下以400G离心管5分钟以沉淀细胞。

使用血细胞计数器计数分离的中性粒细胞，并通过台盼蓝染色评估细胞活力。与一步法相比，两步法的纯度提高了90%。