首先，取出被PBS灌注的斩首小鼠的脊髓。将脊髓浸没在冰上的培养皿中的冷DPBS中。使用 18 号针头和装满冷 DPBS 的 10 毫升注射器，使用液压挤压将整个脊髓隔离在层流罩中。
将脊髓转移到培养皿中，将冷DPBS放在冰袋上。使用层流罩内的显微镜，用锋利的镊子小心地去除任何可见的脑膜。然后，将脊髓转移到空的培养皿中，并使用 10 号手术刀刀片将其切成两到三毫米长的部分。
为了酶解离脊髓细胞，将酶混合物 1 和 2 添加到脊髓片中。在培养皿中旋转酶数次，以确保脊髓涂层均匀。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，每 10 分钟手动旋转一次培养皿。
孵育后，加入 350 微升 DNAse I.轻轻旋转培养皿混合。接下来，加入一毫升补充有0.5%FBS的冷DMEM，然后轻轻混合。立即将全部内容物转移到五毫升管中。
使用P1000移液管，轻轻研磨组织三次。然后，使用塞住的 9 英寸玻璃巴斯德移液管再轻轻研磨组织五次。将管子直立放置 30 秒，让组织沉淀。
使用 P1000 移液器，吸出上清液并通过 30 微米过滤器将其转移到 15 毫升锥形管中。在装有剩余组织的试管中，加入一毫升补充FBS的DMEM。然后，用巴斯德移液管轻轻研磨三次。
让组织沉淀在底部后，将上清液通过 30 微米过滤器并将其收集到之前使用的相同 15 毫升管中。在室温下以300g离心过滤的细胞悬浮液10分钟。使用真空吸气器小心地丢弃上清液。
使用成人脑解离试剂盒中提供的碎片清除溶液从细胞沉淀中去除髓磷脂。然后，在沉淀中加入五毫升补充FBS的DMEM，并轻轻倒置试管三次混合。离心后，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升补充FBS的DPBS中。
在弃去上清液之前再次离心。按照制造商的方案用抗ACSA-2微珠标记细胞。使用磁性分离柱通过阳性选择分离细胞。
然后，在弃去上清液之前，将细胞以300g离心10分钟。接下来，将细胞沉淀重悬于一毫升温热的补充FBS的DMEM中。将细胞悬液转移到血细胞计数器中以计数细胞并评估其活力。
用FBS DMEM将细胞浓度调整至每50微升75,000个细胞。然后，将 50 μL 细胞悬液转移到 24 孔板中的聚 l-赖氨酸包被的盖玻片中。将板在 37 摄氏度下孵育两个小时，以使细胞粘附在盖玻片上。
然后，小心地向每个孔中加入 450 微升温热且补充抗生素的 FBS DMEM。观察到小胶质细胞和星形胶质细胞的成功分离和增殖。到第四天，观察到星形胶质细胞形成更长的过程，同时看到具有较短纺锤体的椭圆形小胶质细胞。
星形胶质细胞在第七天形成一个相连的汇合层，小胶质细胞显示出更少和更短的过程。细胞分选证实了分离细胞培养物的细胞活力为92%至93%。
