首先，在孵育前用 150 微升 0.01% 至 0.1% 细胞附着溶液涂覆微孔培养皿。培养皿风干后，在干燥表面上滴加 80 微升金纳米颗粒溶液。第二天，从微孔中取出任何添加的培养基。
然后在玻璃表面固定的金纳米颗粒上加入两毫升转染细胞。在实验开始前孵育板。使用器官激光设置为 488 纳米的共聚焦显微镜观察膜联蛋白的 GFP 荧光。
将氦氖激光器设置为 633 纳米以观察金纳米粒子反射。选择单细胞而不是细胞簇，以防止质膜重叠。确保固定的金纳米颗粒以单个颗粒的形式存在，并有足够的间距以防止增加热梯度。
使用光学镊子照射金纳米颗粒一秒钟，以破坏质膜。要生成巨大的单层囊泡或 GUV，请在载玻片上涂抹 90 微升加热的 5% PVA 凝胶。将凝胶均匀地涂抹在载玻片上。
然后让载玻片在 50 摄氏度的加热柜中干燥 50 分钟。接下来，使用玻璃注射器涂抹 30 微升脂质混合物。用针边将混合物铺成薄膜。
施加温和的氮气流以蒸发脂质混合物的氯仿。然后在真空下干燥载玻片 1.5 至 2 小时。在一个单独的两毫升试管中，加入 400 微升生长缓冲液。
然后将目标重组蛋白加入终浓度为 500 纳米摩尔。将 400 μL 稀释的蛋白质移液到组装的内部腔室中，并将腔室包裹在 PERIFIL 中。孵育一小时后，将 400 微升腔室内容物转移到 2 毫升管中。
在收集的溶液中加入一毫升观察缓冲液以除去任何未包封的蛋白质。然后在13摄氏度下以600G离心溶液10分钟。接下来，用观察缓冲液代替一毫升上清液，轻轻移液以分散GUV。
冷藏直至实验开始。要刺穿 GUV，首先在 35 毫米玻璃底培养皿的表面涂上 β 酪蛋白。接下来，将5微升150纳米金纳米壳加入含有氯化钙的GUV混合物中。
将混合物转移到腔室中并将其安装在显微镜载物台上。使用光学镊子将单个金纳米壳捕获在GUV表面。当捕获的纳米壳与GUV膜紧密接触时，增加激光功率以刺穿目标部位。
纳米颗粒辐照导致膜损伤，并导致膜联蛋白快速募集到损伤部位，随后钙流入形成环状结构。在GUV实验中，在没有膜联蛋白的情况下，膜穿刺被迅速重新密封。膜联蛋白 A 4 蛋白独特的生物物理特性导致 GUV 由于其滚动膜的能力而破裂。
膜穿刺后，GUV中膜联蛋白的存在导致损伤部位快速积聚。细胞实验中对膜联蛋白 A 5 环的分析表明，它们随时间和空间保持不变。使用热等离子体的质膜破坏导致钙离子水平升高。
细胞在6.6秒时达到最大钙强度，这个时间点被认为与伤口闭合的时间相对应。
