Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

首先，从安乐死解剖小鼠的骨头中取出组织。将清洁后的骨头放入新的六孔板中，该板含有放置在冰上的FACS缓冲液。将骨头转移到装有 2 至 5 毫升 FACS 缓冲液的研钵中。

以圆周运动研磨骨头，直到骨髓释放。用三毫升注射器，向上拉并冲洗骨髓以使其均质化。将匀浆拉入另一个注射器中，然后通过70微米的细胞过滤器将其过滤到50毫升的管中。

在第二次均质化之前，用FACS缓冲液将组织块从过滤器冲洗回研钵中。像以前一样过滤冲洗过的组织。接下来，用FACS缓冲液将剩余的骨针冲洗回研钵中。

然后将碎片冲洗到 15 毫升管中，以确保最大产量。为了消化骨髓，首先在4摄氏度下以300G离心五分钟。将骨髓沉淀重悬于两毫升消化混合物中。

将混合物转移到 15 毫升管中。然后在旋转器上在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。现在，加入 10 毫升 FACS 缓冲液以停止酶消化。

通过70微米的细胞过滤器将混合物过滤到50毫升的管中。在4摄氏度下以400G离心悬浮液7分钟。将沉淀重悬于一毫升红细胞裂解缓冲液中。

接下来，加入 10 毫升 FACS 缓冲液以停止裂解。然后像以前一样将混合物过滤到 50 毫升管中。最后，在4摄氏度下以300G离心混合物五分钟。

弃去上清液后，将沉淀重悬于100μL FACS缓冲液中。为了消化骨针，首先，涡旋骨针。倒出上清液并保留底部的骨头。

接下来，将针状物重悬于一毫升骨针状体消化混合物中。将试管在旋转器上在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。最后，用10毫升FACS缓冲液停止消化。

将混合物过滤到含有红细胞裂解和消化的骨髓的 50 毫升管中。