Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

首先，将分离的鼠骨髓悬浮液与骨针悬浮液混合。将 10 μL 细胞悬液移液到血细胞计数器上进行计数。将细胞悬浮液在300G下在4摄氏度下离心5分钟。

然后将沉淀重悬于100微升FACS缓冲液中。要用磁耗耗抗体对细胞进行染色，请添加 FC 块、CD45 APC 和 TER-119 APC。然后用FACS缓冲液洗涤细胞悬液。

离心剩余的混合物后，将沉淀重悬于100μL FACS缓冲液中。要用微珠对细胞悬液进行染色以进行磁耗，请加入小鼠IgG和抗APC微珠。将混合物在冰上孵育 20 分钟。

用两毫升MACS缓冲液洗涤LD柱。将细胞重悬于缓冲液中，然后通过带有 35 微米细胞过滤器盖的 5 毫升试管过滤。接下来，将LD柱放在磁选机支架上，并在柱下放置一个5毫升的试管以收集洗脱的材料。

将细胞悬液移液到LD柱中，并在试管中收集流经的负馏分。用一毫升MACS缓冲液洗涤色谱柱两次，并将洗脱液材料收集在同一管中。将LD柱放在一个新的5毫升试管上。

用移液管将三毫升缓冲液分配到色谱柱中，然后将阳性标记的细胞冲洗到五毫升试管中。离心正性和负性部分，然后将沉淀重悬于100μL FACS缓冲液中。要对 CD45 TER-119 阴性部分进行染色，每 10 个细胞向第 6 个细胞中加入每种抗体 1 μL。

将悬浮液放在冰上 20 分钟。然后在离心前用两毫升FACS缓冲液洗涤悬浮液。向沉淀中加入一毫升缓冲液，移液器碘化丙啶用于活细胞染色。

最后，在多色流式细胞仪上分析细胞之前，通过 35 微米细胞过滤器将样品过滤到 5 毫升试管中。小动脉内皮细胞在急性髓系白血病微环境中显着扩增，同时在正弦内皮细胞群中丢失。在八周龄时观察到间充质基质细胞的小幅扩张。