Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

要进行类器官接种，首先，从离心机中取出上清液并洗涤肝细胞癌细胞。将细胞重新悬浮在每孔 50 微升基底膜提取物 （BME） 中进行铺板。接下来，将单元格悬浮在高级 DMEM/F12 中。

然后轻轻移液管细胞聚集体，直到看到均匀的悬浮液。将BME添加到悬浮液中，确保BME浓度在30%至50%之间，现在在24孔板的中心接种50微升BME液滴和细胞簇。让液滴在 37 摄氏度下凝固 20 分钟。

向每个孔中加入 500 μL 预热培养基，并在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育。每两到三天刷新一次培养基。两周后，用类器官扩增培养基替换隔离培养基。

培养 7 至 10 天后，一旦类器官达到适当的密度，根据需要处理培养物。要通过类器官，首先在培养箱中预热超低附着表面细胞培养板。接下来，将冷冻的 BME 在 4 摄氏度下解冻过夜，直到使用前。

将类器官收获溶液和胰蛋白酶替代品在 37 摄氏度下预热 30 分钟。在制备阶段之后，从类器官培养板中取出培养基。然后将类器官悬浮液转移到 15 毫升管中。

现在按BME的量比例加入类器官收获液。要混合悬浮液，请使用 1000 微升移液器喷枪上下刮擦和移液。在室温下将试管孵育 30 分钟后，使用 1 毫升移液管小心吸出 BME。

确保 BME 已完全溶解。每 10 分钟监测一次提取物，直到可见清晰的类器官细胞簇。然后在室温下以400g离心5分钟。

尽可能多地去除上清液。要开始酶消化肝细胞癌类器官，请在培养的类器官沉淀中加入一至五毫升预热的胰蛋白酶替代品。将悬浮液在 37 摄氏度下孵育两分钟。

使用显微镜验证类器官是否解离成 2 到 10 个细胞的小簇。要停止消化，请加入适量的冷基础培养基。然后将类器官以400g在8摄氏度下离心5分钟。

小心地去除尽可能多的上清液。将所需数量的类器官重新悬浮在适当的基质中进行电镀。每 10 天通过类器官，具体取决于类器官生长的密度。

在培养后三天内观察到 HCC 类器官球状体。在建立的第一天，可以看到具有圆形边缘和可渗透性胞质溶胶的致密球体。类器官大小相似，在30%至50%BME中培养时直径最大。

BME的碎片最为10%，导致类器官最小。BME在100%时最完整，但产生了中等直径的类器官。增殖的HCC类器官在三代后在每种培养物中的尺寸超过500微米。

在 20 天的培养期内获得大于 1000 微米的 HCC 类器官。