首先,使用镊子从安乐死小鼠解剖的下颌下唾液腺中去除任何脂肪和结缔组织。然后将压盖放入装有冰冷HBSS溶液的收集管中。接下来,用镊子将腺体切成一厘米见方的小块。
将 4% 琼脂糖加热至 50 摄氏度,然后将溶液倒入 35 毫米的培养皿中。将少量琼脂糖溶液倒入单独的培养皿中,然后将腺体块加入其中。然后将多余的琼脂糖中的碎片旋转以覆盖它。
接下来,将四到六块腺体平放在第一个装有琼脂糖的盘子中。将盖子放在盘子上,将其转移到冰盒中,用冰块盖住盘子冷却并凝固。要切片腺体片,首先,使用手术刀小心地切割腺体嵌入的琼脂糖块。
接下来,将一滴强力胶涂在琼脂糖块上,并将其连接到振动切开机的阶段。现在用含有 1% 青霉素链霉素的冰冷 PBS 填充振动切开室。用手术刀修剪掉多余的琼脂糖,并在每块腺体之间留出五毫米的间隙。
将振动切片与琼脂糖块对齐,并设置切片的起点和终点。以低速和高振动将组织块切成 150 微米厚的部分。切片后,用画笔捡起切片,并将它们放入装有含有抗生素的预热RPMI培养基的培养皿中。
要培养下颌下切片,首先,将 1.5 毫升 RPMI 培养基加入六孔板的孔中。将0.4微米过滤器放入孔中。接下来,在画笔的帮助下,小心地将一到六片转移到每个滤镜上。
然后将板在 37% 二氧化碳下孵育 5%。用伽马辐射照射一些实验板以诱导损伤后,将板放回培养箱。接下来,用 500 μL 培养基填充 24 孔板的孔。
用画笔将切片从过滤器中取出,然后轻轻地将它们浸入孔中。将切片在相关核染色剂中孵育。然后在轻轻搅拌下,将切片与抗体在37摄氏度下孵育两个小时。
将切片浸入培养基中三次进行洗涤。让切片在室温下在室温下在温和搅拌下孵育 10 分钟。接下来,使用镊子从双面成像垫片上取下胶带。
将垫片粘在玻璃底六孔板的底部,然后将 50 μL 培养基移液到垫片中心的间隙中。将切片放入培养基中,确保其平放。然后用移液管小心地从间隙中取出 20 微升培养基。
使用镊子小心地从垫片顶部取下胶带,并在其上放置一个 25 毫米的圆形盖玻片。按压垫片边缘以确保盖玻片牢固连接。在共聚焦显微镜上对切片进行成像。
培养 7 天的下颌下腺未辐照切片保留了其 MT 信号和上皮结构。然而,在照射后三天,观察到腺泡和导管细胞萎缩。在照射后 4 天观察到半胱天冬酶阳性细胞。
在辐照切片中观察到升高的γ H2AX,表明体内DNA损伤。巨噬细胞的实时成像证实了切片培养模型中上皮细胞的吞噬作用。可以检测和分割单个细胞,以便对细胞行为进行后续分析,例如迁移。