胰腺导管腺癌细胞的慢病毒制备和重编程转导

1 2 首先，在转染前 24 小时在含有 GMEN 的 15 cm 培养皿中观察 HEK 293T 细胞 3。5 在 37 摄氏度 6 和 5% 二氧化碳 7 下孵育细胞，直到它们达到 40% 至 50% 汇合。8 在三个 15 毫升塑料管 9 上贴上适当的慢病毒名称。

10 向每个试管中加入 1.710 mL 减血清培养基 11 和 90 μL 转染试剂。12 涡旋 13 混合内容物，然后在室温下孵育试管。14 5 分钟后，将包装载体混合物 15 加入转染培养基中并涡旋。

16 然后将 7.5 μg 重编程载体 17 和 pWPT-GFP 对照 18 添加到相应的转染混合物中。19 涡旋试管 2 秒 20 分钟，然后在室温下孵育 15 分钟。21 要用每种慢病毒 22 逐滴转染 293T 细胞，请在培养皿中加入转染 DNA 混合物。

23 在 37 摄氏度 24 和 5% 二氧化碳下孵育转染的细胞。25 14 至 16 小时后，26 用 30 毫升 27 新鲜 293T 培养基 28 更换培养基，并继续孵育 60 至 72 小时。29 每天 30 观察细胞并检查转染效率。

31 接下来，将病毒转染培养物 32 转移到 15 毫升试管 33 中，并在 4 摄氏度下以 1， 932 G 的速度离心 10 分钟 34。35 使用 0.45 微米针头过滤器 37 将慢病毒上清液 36 过滤到新的 50 毫升试管中。38 在慢病毒转导前一天，39 准备 6 孔板 40 的两个孔，每孔含有 100， 000 个 PDAC 细胞。

41 准备两支 15 毫升试管 42 和 2 毫升预热的 PDAC 培养基。43 在第一管中，44 加入 12 mL 重编程慢病毒。45 然后加入 12 μL 聚凝胺 46 并通过移液混合。

47 在第二根试管中，48 加入 2 微升聚凝胺。49 现在小心地从 6 孔板 51 的每个孔 50 中取出培养基，并在室温下用 PBS 洗涤一次。52 将来自试管 1 的重编程感染培养基 53 添加到第一个孔中。

54 将 2 管中的混合物加入 2 个井中。55 将细胞在 37 摄氏度 56 中加入 5% 二氧化碳和 5% 氧气孵育过夜。57 第二天，用新鲜的 PDAC 培养基 59 替换来自两个孔的培养基 58，并继续孵育 60 长达 48 小时，如图所示。