Tissue Embedding and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

首先，将左心房和肺静脉或PV与小鼠的心脏隔离开来。将分离的组织放入冷冻器中，心脏底部和肺尖朝上。解开并解开 PV，以防它们变得复杂。

然后，用OCT化合物填充冷冻器。使用细镊子轻轻按压 PV 而不移动它们以去除残留的空气。在干冰上冷冻OCT化合物中的组织。

对于免疫染色，在染色系统上解冻冷冻小鼠PV载玻片20分钟。然后将几滴 4% 多聚甲醛固定溶液滴到切片上，以将组织固定在载玻片上。孵育后，将载玻片移动到垂直架上，然后将它们浸没在装满PBS的容器中。

将容器放在缓慢的摇床上五分钟以冲洗载玻片。使用含有木二酚的液体阻滞笔，将每张载玻片上的每个部分圈起来。并在染色系统上重新组织载玻片。

使用巴斯德移液管，在每个样品上滴一到两滴透化溶液。然后，通过在 PBS 中洗涤载玻片五分钟来清洁 Triton X-100 溶液。在染色系统上重新排列载玻片后，向每个切片中加入一到两滴封闭缓冲液，确保完全覆盖。

接下来，制备一毫升由一抗和封闭缓冲液组成的一抗混合物。从载玻片中丢弃剩余的阻塞缓冲区。将两到三滴一抗混合物滴入每个切片。

孵育后，将载玻片放在垂直架中，并在洗涤缓冲液中冲洗载玻片五分钟，同时保持温和的搅拌。然后，制备一毫升由二抗和洗涤缓冲液组成的二抗混合物。在染色系统上重新定位载玻片，并使用移液管将两滴或三滴二抗混合物分配到每个切片上。

随后，在摇晃的同时在洗涤缓冲液中清洁载玻片三次，每次五分钟。接下来，将两到三滴Hoechst 33342溶液加入到染色系统上布置的每个部分中。将载玻片放在垂直架子上，并在洗涤缓冲液中轻轻搅拌冲洗五分钟。

在每张载玻片中加入一到两滴荧光封片，并用盖玻片密封载玻片。在10倍放大倍率下观察左心房和肺静脉交界处的肺静脉孔区、肺外静脉和肺间静脉。在 40 倍放大倍率下观察到在肺静脉口、肺外静脉和肺内静脉中具有典型肌肉横纹的特定 cTnT 信号。

Cx43 在所有三个肺部区域均被发现，主要投射在相邻的心肌细胞之间。在心肌套管中心肌细胞的极侧和外侧观察到 Cx43 相关信号。