Isolating Single Cells from Upper Endoscopy Biopsies Derived from Gastric Patients for Organoid Generation

要开始从患者上消化道内窥镜检查期间收集的胃活检中分离单个细胞，首先，让组织沉降在15毫升锥形管的底部。沉淀后，使用移液管吸出培养基，并用一毫升补充抗生素的PBS洗涤活检两次。将至少 20 毫克的组织转移到含有 1 毫升 PBS 的 1.5 毫升试管中，该试管中含有 1 毫升补充有 DTT。

使用精细解剖剪刀将组织切成一到两毫米或更小的碎片。使用台式微型离心机 15 秒，将组织碎片聚集在试管底部，然后吸出尽可能多的上清液。将 5 毫升新鲜加热的消化缓冲液加入 50 毫升锥形管中。

将 500 μL 缓冲液从该试管转移到装有组织片的 1.5 μL 试管中。接下来，使用剪刀从底部切成 1， 000 微升移液器吸头，以增加吸头的直径，以尽量减少组织损失。现在，使用改进的移液器吸头，将小组织块从 1.5 毫升管转移到 50 毫升管中的消化缓冲液中。

将消化缓冲液和组织混合物在37度下孵育30分钟，以200RPM进行轨道振荡。然后，将5毫升含有0.25%EDTA的温胰蛋白酶加入消化缓冲液中的组织中并孵育。通过加入等体积的高级 DMEM/F-12 培养基中和消化缓冲液和胰蛋白酶，并将悬浮液通过 70 微米的细胞过滤器。