通过免疫组化对α-突触核蛋白预成型原纤维 （PFF） 注射小鼠石蜡包埋脑切片进行线粒体形态分析

首先，取PFF注射C57的石蜡脑切片黑色六只小鼠。将载玻片浸入二甲苯替代品中并孵育两分钟，使载玻片脱蜡。为了补水，将载玻片浸入100%95%和70%乙醇中，然后在去离子水中浸泡两次。

将样品与双蒸水一起转移到可微波炉加热的容器中。在4摄氏度下加热100倍柠檬酸盐缓冲液，pH值为6。然后准备350毫升新鲜柠檬酸盐缓冲液。

将准备好的柠檬酸盐缓冲液倒入带盖的塑料容器中。将载玻片放入柠檬酸盐缓冲液容器中并盖上盖子。以 700 瓦的功率对样品进行微波炉加热 4 分钟，然后留出时间休息 5 分钟。

再用微波炉加热 1.5 分钟，然后休息 5 分钟并补充柠檬酸盐缓冲液。微波炉加热 1.5 分钟，静置 5 分钟。然后将样品和柠檬酸盐缓冲液在冰上冷却20分钟，然后用双蒸水洗涤。

使用纸巾擦干样品载玻片，不要接触纸巾。使用巴氏笔，在组织碎片周围绘制矩形。现在将所有载玻片转移到载玻片免疫染色盒中。

用 TBS-T 轻轻清洗它们多次，确保 TBS-T 滴剂留在 PAP 笔矩形内。在纸巾上点击载玻片以取出 TBS-T。向每个矩形中加入 50 微升封闭物，并在室温下孵育一小时。

在孵育结束时，使用纸巾从样品中除去封闭溶液。轻轻地将 50 μL 一抗混合物和 TBS-T 移液到每个矩形中，并将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。然后用TBS-T清洗载玻片。

用纸巾敲击取下 TBS-T。重复此过程三次。接下来，在每个矩形中加入 50 微升 TBS-T 稀释度为 1 至 1000 的二抗混合物，并在 37 摄氏度下在黑暗中孵育一小时。

之后，用TBS-T洗涤样品三次。然后将样品与浓度为每毫升2微克的DAPI在TBS-T中孵育一分钟。敲击纸巾取出DAPI溶液，然后用TBS-T清洗三次。

要安装玻璃盖玻片，请在样品中加入每张载玻片两滴封固试剂。轻轻按压盖玻片以消除气泡，让样品在室温下干燥一小时。使用配备 60 倍油物镜或共聚焦技术的结构照射荧光成像系统对不同领域的至少 50 个细胞进行成像。

要分析细胞，请通过在正细胞或负细胞周围绘制轮廓并使用裁剪函数来分离感兴趣区域。接下来，激活形状描述符并限制为设置测量函数中的阈值选项。通过选择调整菜单中的阈值功能来调整阈值级别。

最后，使用分析颗粒工具并设置适当的大小来捕获线粒体。例如，将大小设置为 25 无穷大，然后激活像素单位并选择显示蒙版“显示酪氨酸羟化酶 VDAC1、PS129 α-突触核蛋白和 DAPI 染色的 PFF 注射小鼠的实质性黑黑。抗 PS129 α-突触核蛋白染色允许将携带 PS129 病变的细胞与健康细胞区分开来。

酪氨酸羟化酶阳性神经元的 VDAC1 染色的图像分析显示，携带 PS129 病变的神经元和缺乏 PS129 病变的神经元之间的线粒体数量和纵横比均有所减少。